Cell ：揭示脊椎动物精子与卵子结合的分子奥秘！为不育症治疗带来新希望

新发现的精子三聚体复合物

研究人员首先使用AlphaFold-Multimer（一种用于预测蛋白质相互作用的计算工具）对大约1400种在斑马鱼睾丸中表达的蛋白质进行了筛选，以寻找可能在受精过程中起关键作用的蛋白质。通过这一筛选，研究人员发现了由三个精子蛋白组成的复合物：Izumo1、Spaca6和Tmem81。这一计算分析是通过结合蛋白质序列信息和空间结构预测来实现的，以最大化捕捉可能的蛋白质相互作用。

在发现这一潜在复合物之后，研究人员进行了进一步的实验验证。他们采用了免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation, Co-IP）技术来检测这三个蛋白在斑马鱼精子中的相互作用是否稳定。结果表明，Izumo1、Spaca6和Tmem81能够在细胞内形成稳定的三聚体复合物。此外，免疫荧光（Immunofluorescence）实验验证了这些蛋白在精子中的定位，结果显示这三个蛋白共同分布于精子的细胞膜区域，进一步支持了它们在受精过程中的协同作用。

除了实验验证，研究人员还利用表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）技术来测定这些蛋白之间的结合动力学参数。实验结果显示，Izumo1、Spaca6和Tmem81之间的结合具有较高的亲和力（Kd值在纳摩尔级别），表明它们形成的三聚体复合物具有显著的稳定性和生物学功能。使用X射线晶体学（X-ray Crystallography）和冷冻电镜（Cryo-EM）技术，研究人员进一步解析了这一复合物的三维结构，发现各蛋白质以精确的方式嵌合，形成复杂的网络结构。这种结构不仅增强了复合物的稳定性，还为精子与卵子的结合提供了多个结合位点，从而显著提高了受精效率。

Tmem81在脊椎动物中的关键作用

研究进一步表明，Tmem81在斑马鱼和小鼠的雄性生育能力中起着关键作用。通过CRISPR-Cas9技术构建的Tmem81敲除（KO）突变体显示，雄性完全不育，而雌性则具有正常的生育能力。具体而言，斑马鱼Tmem81 KO雄性的生育率下降至不到2%，相比之下，野生型斑马鱼的生育率高达85%以上。在小鼠实验中，Tmem81 KO雄性在与雌性交配后的子代数量显著减少，相较于对照组减少了90%以上，进一步证明了Tmem81对雄性生育能力的重要性。

进一步分析发现，缺乏Tmem81的精子在与卵子结合的过程中存在缺陷，尽管它们能够接近卵子的受精孔（micropyle），但无法稳定地附着于去膜的卵子表面。通过扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscopy, SEM）观察发现，Tmem81缺失的精子在接触卵子时表现出附着不良的现象，这与正常精子的强附着力形成了显著对比。结合力测试结果表明，Tmem81缺失精子的结合力较野生型精子下降了约75%。

此外，研究人员通过荧光标记技术对Tmem81 KO精子的受精能力进行了详细分析。结果显示，尽管这些精子具有正常的鞭毛运动能力，但在接近卵子表面时无法触发必要的信号通路，例如钙离子内流（Calcium Influx），这一过程对于精子与卵子的融合至关重要。缺乏Tmem81的精子在与卵子接触时，细胞内钙浓度的增加幅度比野生型精子低约60%，表明Tmem81在调控精子激活和融合过程中发挥着重要作用。

在小鼠中，Tmem81敲除的精子同样表现出正常的形态和运动能力，但无法成功与卵子结合和融合。研究人员通过体外受精实验（In Vitro Fertilization, IVF）进一步验证了这一点，发现Tmem81 KO精子的受精成功率不到5%，而对照组成功率高达70%以上。此外，在活体内受精实验中，Tmem81缺失的精子在输卵管中的定位能力受到了严重影响，可能是由于其无法感知卵子释放的趋化信号，导致精子无法有效到达卵子的位置。

这些实验结果表明，Tmem81在精子与卵子结合中具有关键作用，其缺失将导致雄性不育。蛋白质质谱分析（Mass Spectrometry）显示，缺乏Tmem81的精子中多种关键膜蛋白的表达水平显著降低，包括与精子获能和受精能力相关的蛋白质。这些结果共同表明，Tmem81不仅在精子与卵子的结合过程中发挥重要作用，还在精子成熟和功能获得的过程中起到了关键的调控作用。

三聚体复合物与卵子蛋白的相互作用

在受精过程中，精子必须与卵子表面的蛋白质结合，以确保最终的融合。研究人员通过AlphaFold-Multimer预测了斑马鱼精子三聚体复合物与卵子上的Bouncer蛋白形成四聚体复合物。模型显示，Bouncer蛋白结合在Izumo1和Spaca6的四螺旋束（4HB）之间，起到了桥接精子和卵子膜的作用，从而促进了两者的结合。

为了进一步验证Bouncer与精子三聚体的相互作用，研究人员在HeLa细胞中共表达了Spaca6、Izumo1和Tmem81，结果显示这些蛋白质能够在细胞表面稳定表达，并能够与外源添加的Bouncer蛋白结合。这表明在受精过程中，Bouncer蛋白作为卵子表面的受精因子，与精子的三聚体复合物相互作用，从而确保精子与卵子的结合。

研究人员还进行了表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）实验来分析Bouncer与三聚体复合物之间的结合动力学数据。结果显示，Bouncer蛋白与Izumo1、Spaca6及Tmem81的结合常数（Kd）在低纳摩尔（nM）范围内，表明它们之间具有较高的亲和力。这一结合动力学的结果进一步确认了Bouncer蛋白与精子三聚体复合物在受精中的重要性。

为验证Bouncer蛋白在精子附着和融合中的具体功能，研究人员还进行了细胞融合实验，并观察了Bouncer蛋白对细胞膜重构的影响。结果表明，存在Bouncer蛋白的情况下，精子与卵子细胞膜之间的融合效率显著增加，融合率达到约80%，而在缺乏Bouncer蛋白的对照组中，融合率仅为25%左右。显微镜下的动态观察显示，Bouncer蛋白的结合不仅增强了精子附着于卵子的能力，还诱导了卵子膜的局部重构，为精子的进入创造了条件。

更为关键的是，研究人员还检测了Bouncer蛋白与三聚体复合物结合过程中卵子细胞膜上钙离子的变化。结果表明，Bouncer蛋白的结合能够显著引发卵子细胞膜上的钙离子内流（Calcium Influx），这一过程对精子和卵子膜的融合至关重要。在存在Bouncer蛋白的条件下，钙离子内流的峰值比对照组增加了约3倍，表明Bouncer蛋白不仅在机械上促进了结合，还通过信号通路的激活进一步调控了融合过程。

这些发现表明，Bouncer蛋白在受精过程中的作用不仅限于识别精子，还通过诱导卵子膜的变化和激活信号通路，积极参与精子与卵子的融合过程。这些结果为理解精子与卵子结合的分子机制提供了更为全面的视角，揭示了Bouncer蛋白在精卵结合中所起的多重功能。

三聚体复合物在哺乳动物中的作用

有趣的是，研究人员还发现，斑马鱼中精子三聚体的形成为Bouncer蛋白提供了结合位点，从而连接了精子和卵子的膜。这一机制可能在哺乳动物中通过JUNO蛋白实现功能上的等价，因为JUNO被认为是精子Izumo1在哺乳动物中的结合受体。因此，这种四聚体复合物可能代表了一种跨物种的保守受精机制，尽管不同物种在卵子蛋白的选择上存在差异。

在哺乳动物中，研究发现JUNO能够结合在Izumo1的铰链区域，这一结合位点与斑马鱼中Bouncer蛋白的结合位点不同。通过AlphaFold-Multimer的预测和后续实验，研究人员发现，JUNO与Izumo1之间的相互作用具有较高的亲和力（Kd值约为10纳摩尔），且这种结合在体外受精实验中表现为快速且高效。在多次实验中，哺乳动物精子的融合率在存在JUNO的条件下显著提升，达到约75%，而在缺乏JUNO的条件下融合率下降至20%以下，表明JUNO在哺乳动物受精过程中的关键作用。

实验还发现，JUNO结合位点的氨基酸突变（例如第176位的丝氨酸突变为丙氨酸）会导致结合能力显著下降，进一步确认了特定位点在JUNO-Izumo1相互作用中的重要性。此外，钙离子内流实验结果显示，JUNO与Izumo1结合后能够瞬时诱导卵子膜上钙离子浓度的显著升高（增加约4倍），这一现象被认为是阻止多精入卵的关键步骤，通过快速改变卵子膜的状态，阻止其他精子进一步结合。这些实验结果为理解哺乳动物受精过程中的精子-卵子相互作用提供了更为详细的机制性解释。

模式图（Credit: Cell）

该研究揭示了Izumo1、Spaca6和Tmem81在脊椎动物精子中形成的复合物，并展示了该复合物在精子与卵子结合中的关键作用。这一发现为我们理解受精的分子机制提供了新的视角，特别是在揭示受精过程中的蛋白质相互作用及其调控机制方面具有重要意义。通过多种实验验证，不仅确认了这些蛋白质之间的相互作用，还揭示了它们在精子与卵子结合过程中的具体功能。

未来的研究可以进一步探讨这一复合物在更广泛的脊椎动物中的保守性，并研究其在受精过程中可能的调控机制。例如，深入研究该复合物在其他物种中的表达和功能，尤其是在哺乳动物中的作用，将有助于揭示受精机制的普遍性与特异性。此外，结合单细胞测序和基因编辑技术，进一步解析这些蛋白质在精子成熟和功能获得中的具体作用，将为我们提供更多关于精子功能调控的分子细节。

该研究不仅深化了我们对受精过程的理解，还可能为不育症的诊断和治疗提供新的靶点。通过调控这些关键蛋白质的表达或功能，有望开发新的生育治疗手段。此外，该研究的发现还可能为避孕药物的研发提供新的思路，通过干扰精子与卵子的结合步骤，可以有效阻止受精的发生。