Cell Discovery | 新突破：改良Cas13d实现高效的胞浆RNA靶向治疗

核质转运Cas13d的开发：研究中开发的核质转运Cas13d（nucleocytoplasmic shuttling Cas13d, Cas13d-NCS）能有效将CRISPR RNA（crRNA）从核内转移到细胞质，实现了在细胞质内靶向降解RNA。

提升对细胞质RNA病毒的抗病毒效能：该系统针对如委内瑞拉马脑炎（Venezuelan equine encephalitis, VEE）病毒和多种严重急性呼吸综合症冠状病毒2（SARS-CoV-2）的菌株显示出显著的抗病毒活性，能完全阻断这些病毒的复制。

潜在的临床应用前景：Cas13d-NCS展示了其在精确调控亚细胞层面RNA靶向和开发新型分子工具及治疗RNA相关疾病的巨大潜力。

Cas13d-NCS（核-胞质穿梭型Cas13d）为高效靶向细胞质RNA和抗病毒设计的工程过程。

a. Cas13d蛋白及其crRNA在哺乳动物细胞中的表达和定位的示意图。Cas13d-NES在C端具有一个NES，对应于v5变体。

b. 使用RNA FISH染色技术，对表达核定位Cas13d-NLS（含3个NLS，即核定位序列，对应于f中的v1）的细胞中的crRNA及GAPDH mRNA进行染色的结果。

c. Cas13d-NCS的示意图，显示其如何将crRNA从核部运输到细胞质。

d. 与核型（v1）或穿梭型Cas13d（v3）共表达的由RNA聚合酶III表达的crRNAs的RNA FISH染色。

e. 对共表达的核型和穿梭型Cas13d的细胞中细胞质/总crRNA染色强度的定量分析。

f. 不同NLS/NES组合的Cas13d穿梭构建的示意图。

g. 不同变体v1-v5的Cas13d蛋白在细胞质/总蛋白染色强度的定量分析。

h. 比较了Cas13d变体v1-v5在纳米荧光素酶表达抑制方面的效果。

i. VEE病毒报告子复制体的示意图。

j. 短期和长期培养后表达复制体的细胞的荧光成像。

k. 使用流式细胞术比较核型和穿梭型Cas13d-NCS在靶向复制体效率上的结果。

l. 针对单一3'UTR crRNA靶向的SARS-CoV-2-GFP报告病毒和病毒转录组的示意图。

m. 在不同靶向条件下通过整合GFP强度实时测量SARS-CoV-2-GFP病毒载量。

n. 在用Cas13d-NCS和靶向或非靶向3'UTR crRNA处理48小时后，通过RNA测序分析SARS-CoV-2（Delta）亚基因组mRNA表达。（Credit: Cell Discovery）

在该研究中，研究人员面临的主要问题是Cas13d蛋白在哺乳动物细胞内的活性主要局限于细胞核，这限制了其在RNA病毒靶向中的应用。为了解决这一问题，研究团队设计了一种能够在核质之间穿搭的Cas13d，称为核质穿搭Cas13d（Nucleocytoplasmic Shuttling Cas13d, 简称Cas13d-NCS）。这种新型Cas13d可以将位于细胞核中的crRNA（CRISPR RNA）转移至细胞质中，进而在那里与目标RNA结合并降解它们。

具体方法上，首先是对Cas13d蛋白进行遗传工程改造，添加了核定位信号序列（Nuclear Localization Sequence, NLS）和核输出信号序列（Nuclear Export Sequence, NES）。通过这些序列的配置，改进后的Cas13d能够与crRNA在细胞核中形成复合体，然后通过NES将其运输出核，实现在细胞质中的活性。

研究团队通过各种设计的蛋白质搭配版本进行筛选，并对系统最佳表现的设计参数进行了进一步研究。他们发现，Cas13d-NCS在细胞质中对mRNA以及来源于委内瑞拉马脑炎（VEE）病毒的自我复制RNA的降解效率远超传统的核定位Cas13d。

此外，通过流式细胞术比较了不同Cas13d变体对RNA病毒靶向的效能，结果显示Cas13d-NCS能够显著提高对细胞质RNA的靶向和降解效率。最终，这种新型Cas13d被用于阻断不同SARS-CoV-2毒株的复制，显示出其在开发RNA病毒靶向治疗上的巨大潜力。

总的来说，Cas13d-NCS的开发不仅优化了Cas13d的亚细胞定位，也大大提高了其在RNA病毒防治中的应用潜力，为使用CRISPR技术进行细胞精准RNA靶向提供了新的策略。

Cas13d 在 RNA 靶向中的传统应用及其局限性

传统应用

Cas13d 是一种 CRISPR/Cas13 系统中的编程工具，被广泛用于 RNA 靶向操作。Cas13d 被认为是在哺乳动物细胞中最活跃的 Cas13 亚型，用于各种 RNA 靶向应用，如抗病毒治疗。尤其在抗病毒领域，近期研究显示 Cas13d 能够针对多种人类 RNA 病毒展现出抗病毒潜力。

局限性

尽管 Cas13d 在 RNA 靶向技术中具有前景，其在细胞质中的活性却非常有限，主要局限于细胞核内。这一限制显著影响了其在编程抗病毒治疗中的应用，因为大多数 RNA 病毒都在细胞质中复制。这意味着现有基于 Cas13d 的抗病毒策略主要依赖于核酸的不受控制泄漏，从而限制了其效率。此外，Cas13d 导向 RNA (crRNA) 的核定位是 Cas13d 偏好核内活性的根本原因。由于 mRNA 在转录后会迅速被运输到细胞质，传统的 Cas13d-NLS (Nuclear Localization Sequence) 系统在识别和绑定目标 mRNA 的时间窗口非常短暂。

Cas13d-NCS在胞质中的RNA靶向效率

Cas13d-NCS的胞质转运机制

Cas13d-NCS是通过对Cas13d蛋白（Cas13d）进行工程改造，使其能够在细胞核和胞质之间穿梭（nucleocytoplasmic shuttling），从而改善其在胞质中的活性。这种改造使Cas13d-NCS能够将原本主要在细胞核中的CRISPR RNA（crRNA）有效转移到胞质中，增强其识别和降解胞质RNA的能力。Cas13d-NCS通过结合核定位序列（nuclear localization sequence, NLS）和核输出序列（nuclear export sequence, NES）来实现这一功能。

Cas13d-NCS在胞质中的表现

在体外实验中，Cas13d-NCS显示出比常规Cas13d（Cas13d-NLS）更高的胞质RNA靶向和降解效率。特别是在对委内瑞拉马脑炎（VEE）病毒的RNA复制体进行靶向时，Cas13d-NCS展现出显著的RNA降解能力。此外，流式细胞术的数据显示，与常规Cas13d相比，Cas13d-NCS在胞质中的靶向和降解效率显著提高。

抗SARS-CoV-2和其他RNA病毒的潜力

Cas13d-NCS在抗病毒应用中表现出极高的潜力。通过靶向SARS-CoV-2病毒的3'非翻译区（3'untranslated region, 3'UTR），Cas13d-NCS成功阻断了多种SARS-CoV-2毒株的复制。研究中还利用实时荧光显微镜跟踪了48小时内SARS-CoV-2-GFP病毒载体的感染过程，结果显示Cas13d-NCS能完全阻止病毒复制。这证明了Cas13d-NCS在胞质中靶向和降解病毒RNA的能力，为其作为一种可编程抗病毒疗法提供了实验依据。

潜在的局限性

效率依赖性：虽然Cas13d-NCS在细胞实验中显示出较高的效率，但其在不同细胞类型中的普适性和效率尚未详细报告。不同细胞类型可能因为核质运输机制的差异而影响Cas13d-NCS的功能。

安全性问题：尽管研究中进行了初步的靶向精确性分析，但长期的生物安全性和潜在的非靶向效应（off-target effects）还需要进一步研究。尤其是当考虑将此技术应用于临床治疗时，非靶向效应可能导致未预见的生物学后果。

系统的复杂性：该研究中的Cas13d-NCS系统需要精确设计和优化多种生物分子，包括不同比例的核定位序列（nuclear localization sequence, NLS）和核输出序列（nuclear export sequence, NES）。这种系统的构建和验证增加了研究的复杂性。

技术转化的挑战：虽然该系统在体外实验中表现良好，但其在体内模型中的表现和实际应用还需进一步验证。体内环境的复杂性可能影响Cas13d-NCS的效率和稳定性。

成本和可接受性：开发和生产具有特定设计的Cas13d-NCS可能涉及较高的成本和技术要求，这可能限制了其在低资源环境下的广泛应用。

潜在的研究方向

优化Cas13d-NCS的设计：尽管当前的Cas13d-NCS表现出优越的细胞质靶向能力，但仍存在进一步提高其稳定性和靶向准确性的空间。未来的研究可能会探索更多的核定位序列 (nuclear localization sequence, NLS) 和核出口序列 (nuclear export sequence, NES) 的组合，以找到更有效的配置。

广泛的病毒类型应用：该研究证明了Cas13d-NCS对SARS-CoV-2和委内瑞拉马脑炎病毒 (VEE) 的高效作用。未来可以扩展其应用到其他RNA病毒，如流感病毒和HIV，看看这种技术是否同样有效。

临床应用的研究：虽然该研究在体外细胞模型中取得了显著成效，但Cas13d-NCS在动物模型中的效果及其安全性仍需进一步验证。此外，探索如何将这种技术转化为实际的抗病毒疗法，例如通过适当的递送系统（如脂质纳米粒子）来保证治疗剂的稳定性和有效性。

副作用和脱靶效应的研究：尽管Cas13d-NCS对目标RNA的剪切效率高，但其潜在的副作用和脱靶效应 (off-target effects) 的研究也非常重要。需要更多的研究来评估其对宿主细胞的影响，确保长期应用的安全性。

与其他CRISPR系统的比较研究：比较Cas13d-NCS与其他CRISPR系统（如Cas9和Cas12）在不同细胞类型和条件下的效率和特异性，可能揭示更多关于这些系统工作机制的信息，也可能帮助开发出更为精确的基因编辑工具。