Cancer Cell：王凌华团队在单细胞层面描绘胃癌进展过程中免疫和间质细胞状态及生态型演变

胃腺癌（GAC）由于其快速进展、普遍对治疗的耐药以及高转移率，在全球范围内依然是最致命的癌症之一，急需在GAC的早期或癌前阶段就采取有效的治疗策略。然而，我们对胃癌从慢性萎缩性胃炎（chronic atrophic gastritis ，CAG）和肠化生（intestinal metaplasia ，IM）等癌前病变，进展到侵袭性局部癌症，再到远端转移的演变机制的了解仍然不足。

腹膜转移（Peritoneal carcinomatosis ，PC）是胃癌的一种常见的转移形式，约在45％的患者中出现，占所有复发的60％。PC患者会经历进行性症状和临床状况迅速恶化，大部分患者在6个月内死亡。研究表明，HER2靶向治疗可以在有限的人群中改善生存，免疫检查点抑制剂联合化疗可使一部分晚期或转移性GAC患者受益。详细探索胃癌发展过程中不断演变的肿瘤微环境（TME），有助于揭示各种免疫抑制机制和潜在治疗靶点，从而有利于我们制定更有效的治疗策略。因此，了解TME的复杂性至关重要。

单细胞测序技术的飞速发展为我们研究肿瘤提供了很好的平台。以往在单细胞层面的研究工作主要集中在胃癌的肿瘤细胞上，只有少数研究工作探索了GAC的免疫微环境，而这些工作受到了样本量和分析深度的限制。

2023年7月6日，德克萨斯大学MD安德森癌症中心王凌华团队在 Cancer Cell 期刊发表了题为：Evolution of Immune and Stromal Cell States and Ecotypes during Gastric Adenocarcinoma Progression 的研究论文。

研究团队收集并分析了来自胃腺癌癌前病变、原发病灶、转移组织的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，以及未受累的正常组织和外周血样本。他们深入刻画了在不同GAC阶段肿瘤微环境（TME）中免疫和基质细胞群体的转录状态、细胞组成、分化轨迹、细胞间的相互作用以及细胞生态类型（ecotype）。

这项研究提供了对于胃腺癌进展过程中免疫和基质细胞演变的详细图谱，并揭示了潜在的研究靶点，也为未来的研究提供了宝贵的资源。这项研究也是迄今为止在胃癌免疫微环境领域中涉及的样本量最大、样本类型最丰富的一项研究工作。

研究团队收集了来自43名患者的68个样本生成的免疫和基质细胞的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据。这些样本覆盖了GAC发展的各个阶段，包括癌前病变（CAG和IM）、原发GAC，以及腹膜、卵巢和肝脏的转移灶。他们还收集了部分患者的配对非肿瘤肿瘤旁组织（NAT）、正常胃组织（NGT）和外周血单核细胞（PBMCs）样本。

此外，他们还收集了两位健康供体的PBMCs作为对照。经过严格的质量控制筛选，研究者共保留了77,392个高质量的细胞进行后续的分析。他们在这些细胞中识别出了10个主要的细胞谱系，可以进一步归类为3个主要的细胞谱系，包括淋巴细胞（占77％，例如T细胞，B细胞，NK细胞和浆细胞）、髓系细胞（占13％，例如pDCs，肥大细胞和其他髓系细胞）以及基质细胞（占10％，例如成纤维细胞，内皮细胞和间皮细胞）。研究团队进一步在每个主要的细胞类型中定义细胞亚群，一共识别了62种不同的细胞亚群。

为了探索这62种表型多样的免疫和基质细胞亚群在TME中是如何构建成细胞“生态系统（ecosystem）”，以及这些细胞生态系统在GAC进展过程中如何演变，研究团队对每个样本中的细胞组成进行了定量分析。他们运用无监督聚类分析，推测了各细胞之间的关系以及共存模式， 即细胞生态型（ecotype）。

该研究发现了6个细胞生态型（EC1-6）。每个细胞生态型都由特定的细胞类型/状态组成，表现出独特的细胞组成和共存模式。有趣的是，这些细胞生态类型与样本类型有关。EC1包括所有的PBMC样本，主要由单核细胞、NK细胞和CD4+/CD8+ naïve T 细胞组成；EC2主要富集在转移性GAC样本中；EC4在癌旁组织中占主导地位；EC5在癌前病变中最为常见；而原发性胃癌主要由EC3和EC6组成。尽管EC3和EC6都是原发性胃癌中发现的的细胞生态型，但两者的细胞组成存在显著差异。EC3主要由CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞、MAIT细胞和DC等免疫细胞组成，而EC6则主要由基质细胞亚群组成。

接下来，研究团队在原发性GAC样本中对EC3和EC6进行了的临床相关性分析。他们采用去卷积方法在三套大型胃癌公共数据集中推断是否存在类似EC3和EC6的细胞生态型。结果显示，在三套独立的数据集中均存在类似EC3和EC6的生态型，他们将其定义为EC3-like和EC6-like。并且，EC3-like和EC6-like与先前定义的组织学、基因组学、分子亚型和临床结果表现出显著的相关性。在三套独立数据集中，都一致的显示EC3-like细胞生态型在肠型GAC中富集，而EC6-like细胞生型在侵袭性弥漫型GAC中占主导地位。TCGA的原发性GAC数据显示，EC3-like细胞生态型在EB病毒（EBV）阳性肿瘤中高度富集，而EC6-like细胞生态型主要在基因组稳定（GS）的肿瘤中富集。与EC3-like细胞生态型肿瘤的患者相比，带有EC6-like细胞生态型的患者的生存时间显著缩短。最常见的染色体不稳定（CIN）亚型包含了EC3-like和EC6-like细胞生态型，频率相似，但有趣的是，当进一步将CIN亚型样本分为EC3-like和EC6-like两组时，带有EC6-like细胞生态型的患者的总生存时间显著短于带有EC3-like细胞生态型的患者。此外，来自三套数据集的分析结果均显示，免疫抑制检查点基因PD-L2、LILRB2、TIM-3和LAIR1在EC6-like样本中的表达水平显著高于EC3-like。综上所述，基于细胞生型的样本分类与原发性胃癌的基因组、组织病理学和临床特征存在相关性。

基于基质细胞组成比例高与较差生存关联的研究结果，为了进一步识别基质细胞中高表达的潜在治疗靶点，研究团队对157个免疫检测点基因和免疫调节基因进行了综合分析，并最终确定SDC2作为研究对象。在三套独立的单细胞测序数据集中，SDC2在基质细胞，尤其是myCAF 型成纤维细胞中表达最高。SDC2在癌前病变和原发癌的基质细胞中的表达水平显著高于正常组织。为了验证SDC2在蛋白水平的表达，研究者对原发性胃腺癌组织进行了双重免疫荧光染色，结果显示基质细胞中SDC2呈强阳性。值得注意的是，SDC2在弥漫型胃腺癌中的表达水平明显高于肠型胃腺癌，而弥漫型胃腺癌以其不良的预后而闻名。

综上所述，SDC2在成纤维细胞中的表达水平与疾病的侵袭性表型相关。研究团队进一步在三套独立的RNA测序数据和组织微阵列（Tissue microarrays）数据中观察到SDC2 高表达与较差的预后相关。另外，研究团队发现SDC2在其他多种癌症类型（包括胰腺癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌以及透明细胞肾细胞癌）的基质细胞中均有较高的表达水平，这暗示了其在肿瘤进展中可能具有潜在作用。最后，研究团队利用小鼠异种移植模型证实了在成纤维细胞中，SDC2表达上调可以促进肿瘤生长。

MD安德森癌症中心王凌华博士为论文通讯作者，Jaffer. A. Ajani博士为本文的共同通讯作者。第一作者王瑞萍博士现在王凌华实验室工作。共同第一作者包括MD安德森癌症中心的宋淑梅博士和浙江省肿瘤医院的覃江江博士。