《自然·遗传学》：让癌细胞“甩不掉”T细胞的基因突变，找到了！

近年来，肿瘤免疫治疗发展迅速，在抗肿瘤领域取得了长足的进步，极大地改善了肿瘤患者的生存状况。

其中，免疫检查点阻断疗法（ICB）是目前应用较多的一种肿瘤免疫疗法，这种疗法能够通过阻断免疫检查点，有效恢复T细胞的功能，激活抗肿瘤免疫应答[1]，从而提高抗肿瘤疗效。

尽管ICB治疗被证实对多种类型的肿瘤有效，但仅有少数患者能从ICB治疗中长期获益。那么，到底是什么原因造成了癌症患者对ICB治疗的响应差异呢？

近期，来自美国克利夫兰诊所免疫治疗与精准肿瘤中心的Timothy A. Chan团队，在《自然·遗传学》杂志上发表了重要研究成果[2]，找到了一个重要影响因素。

他们的研究发现，携带DNA聚合酶ε（POLE）和DNA聚合酶δ1（POLD1）功能性突变的肿瘤对ICB治疗更加敏感。让研究人员吃惊的是，POLE/POLD1突变特征谱与肿瘤新抗原的生化特征密切相关。

从机制上讲，引起POLE/POLD1功能相关的特征改变，使肿瘤细胞产生了“叛徒”新抗原，这些新抗原与T细胞受体接触的残基处疏水性增强，促进了T细胞对肿瘤细胞的识别。

此外，他们的研究表明，基于POLE/POLD1功能性突变特征的模型，在筛选对ICB治疗受益的患者方面，优于其他几种传统模型。

论文首页截图

自ICB治疗被美国FDA批准应用于临床以来，Timothy A. Chan团队一直致力于研究影响患者对ICB治疗获益差异的遗传学因素。

他们团队的先前研究表明，DNA损伤修复（DDR）途径的致病性改变与患者对ICB治疗响应的增强有关[3-5]。如错配修复缺陷（MMRd）会导致微卫星不稳定（MSI）及增加肿瘤突变负荷（TMB），使肿瘤细胞产生更多的新抗原，促进肿瘤对ICB治疗的敏感[6]，而高MSI及高TMB也是美国FDA批准的ICB疗法的两个重要标志物。

由于编码DNA聚合酶的基因是DDR基因，近4%的肿瘤均会发生这两个基因的突变[7]。最近也有不少研究报道携带POLE/POLD1致病性突变的肿瘤高度浸润免疫细胞，提示了这些突变可能有利于改善免疫识别，从而促进患者对ICB治疗的响应[8,9]，然而POLE/POLD1功能性突变与ICB治疗获益之间的具体机制仍尚不清楚。

鉴于前人及本团队的研究基础，Timothy A. Chan团队这次将通过免疫基因组学、动物模型及临床数据统计分析等手段，对POLE/POLD1的功能性突变与ICB治疗响应的分子机制进行全面解析。

接下来我们就一起来看看Timothy A. Chan团队是如何开展这个研究的。

由于小鼠的POLE/POLD1与人类的高度同源，因此，研究人员首先通过CRISPR-HDR基因编辑技术，构建了POLE^P286R位点突变的小鼠B16F10黑色素瘤细胞系，在体外传代8周后，检测到突变细胞系中，新发单核苷酸变异比亲本细胞系增加4.7倍。

于是，研究人员将所建立的POLE^P286R位点突变小鼠黑色素瘤细胞系移植到C57BL/6J小鼠身上，研究它们对ICB治疗的敏感性。

对比亲本细胞系所建立的移植瘤模型，无论是ICB单药治疗（PD-1或CTLA-4抑制剂）还是联合治疗，移植POLE^P286R位点突变的B16F10黑色素瘤细胞的小鼠，对ICB治疗的敏感度显著上升，肿瘤大小均得到了显著的抑制，并且肿瘤组织中浸润了更多的CD3⁺T细胞，至少是亲本细胞系的三倍。甚至仅接受对照免疫球蛋白IgG治疗的小鼠，POLE^P286R位点突变的肿瘤也较亲本细胞浸润了更多的免疫细胞。

携带POLE/POLD1功能性突变的小鼠肿瘤对免疫治疗敏感

以上结果表明，POLE^P286R位点突变的肿瘤在接受治疗前就已经进入免疫激活状态，这有利于响应ICB治疗。

研究人员还在小鼠结肠癌CT-26细胞上重复了上述实验，得到了类似的实验结果，表明POLE^P286R位点突变增强肿瘤对ICB的敏感性可能与肿瘤类型无关。

接下来，为了阐明POLE功能性突变如何影响肿瘤微环境，研究人员将POLE^P286R位点突变的B16F10移植在免疫缺陷的裸鼠及免疫功能正常的C57BL/6J小鼠上。

结果显示，在免疫缺陷的裸鼠上，突变肿瘤与亲本肿瘤生长速度相似，而在免疫功能正常的C57BL/6J小鼠上，突变肿瘤生长速度明显小于亲本肿瘤。

这表明，C57BL/6J小鼠对突变肿瘤有更强的免疫监测功能。

POLE功能性突变增强肿瘤免疫原性

随后，研究人员对接受ICB治疗前后的突变肿瘤及亲本肿瘤进行转录组测序及免疫流式分析，发现POLE^P286R突变的肿瘤在接受ICB治疗前及治疗后，均浸润了更多的CD8⁺T细胞、NK细胞等，且功能激活的CD8⁺T细胞比例及PD-1⁺的CD8⁺T比例增高；而肿瘤相关巨噬细胞中M2型巨噬细胞、骨髓来源的抑制细胞MDSC、免疫抑制调节细胞Treg比例显著下降。

这些结果表明，POLE功能性突变改变了小鼠的适应性及先天性免疫应答，使肿瘤免疫微环境处于激活状态。

那么，POLE功能性突变到底是怎样干预肿瘤免疫微环境的呢？

由于POLE^P286R突变细胞系可以在体外培养期间积累单核苷酸变异（SNV），研究人员想通过探索这些突变模式的特点来解答上述问题。

正如预期的那样，尽管亲本和突变细胞系的六种SNV类别特征相似，但POLE突变细胞系可以诱导不同的突变模式，通过统计学分析，研究者们将这些突变特征总结为mSigA、mSigB和mSigC三类。这些结果表明，POLE^P286R突变在小鼠肿瘤细胞系中产生的新发SNV类型，与在具有POLE功能突变的患者样本中观察到的相似。

POLE突变细胞系可以诱导不同的突变模式

接下来，基于POLE功能性突变的特征，研究者们试图建立一种Logistic回归模型，以预测肿瘤样本是否存在POLE/POLD1功能突变。

Timothy A. Chan团队使用已知POLE/POLD1功能突变的肿瘤样本和POLE/POLD1野生型的肿瘤样本生成训练集，用来自ICGC和CCLE数据集的样本生成测试集，以评估模型的性能。

然后他们将经过训练的统计模型对TCGA、ICGC和CCLE数据库中的POLE/POLD1未明变异的肿瘤样本进行分析，从而成功鉴定并识别了包含POLE/POLD1功能性突变的潜在样本。

基于突变特征的统计模型可以从WES数据和靶组测序数据中准确识别具有POLE/POLD1功能突变的肿瘤

最后，研究者们进一步分析了TCGA数据库中子宫内膜癌队列的数据集，发现了与小鼠POLE^P286R肿瘤具有相同的免疫特征，即携带有POLE/POLD1功能突变的患者肿瘤比不含的患者有更多的免疫细胞浸润。

POLE/POLD1功能突变特征的肿瘤具有更高的免疫活性

为了确定POLE/POLD1功能性突变对接受ICB治疗后结局的独立影响，Timothy A. Chan团队利用他们所构建的模型，分析了一个回顾性泛癌ICB治疗队列的研究数据库。

这个数据库包含2700名微卫星稳定（MSS）和低度微卫星不稳定（MSI-L）的患者，他们发现携带POLE/POLD1功能相关特征的患者对ICB治疗敏感，能够产生持久的临床效益，而且与不携带POLE/POLD1功能性突变的患者相比，无进展生存期更长。

在抗PD-1/PD-L1免疫治疗后，具有POLE/POLD1功能突变特征的患者生存期延长

此外，研究人员还发现，与体细胞超突变、核酸内切酶结构域突变等传统检测方法相比，他们所建立的模型有利于识别能够从免疫治疗中获益的患者，更有益于指导临床用药。

POLE/POLD1功能相关特征评估模型优于其他传统方法

鉴于POLE/POLD1功能相关特征对ICB治疗获益的优秀预测效果，Timothy A. Chan团队进一步探索其潜在的分子机制。

他们发现，携带POLE/POLD1功能性突变的肿瘤样本中的抗原肽，比POLE/POLD1阴性的疏水性更强，且与T细胞受体接触的残基处疏水性也显著提高。这意味着POLE/POLD1功能性突变特征改变了肿瘤新抗原的疏水性，增强了免疫原性。

总的来说，Timothy A. Chan团队的研究证明了POLE/POLD1功能性突变足以诱导人和小鼠的抗肿瘤免疫功能，增强对ICB的治疗的敏感度，而且这种效应可能与肿瘤类型无关。

更有意义的是，他们还构建了优于传统方法的评估模型，能够识别对ICB治疗敏感的患者，对指导临床用药具有重大意义。

参考文献：

[1] Wei G, Zhang H, Zhao H, et al. Emerging immune checkpoints in the tumor microenvironment: Implications for cancer immunotherapy[J]. Cancer Lett, 2021, 511: 68-76.

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