超越CRSIPR，线粒体靶向的ARCUS核酸酶，消除线粒体致病基因突变

迈阿密大学米勒医学院和Precision公司的研究人员在 Nature 子刊 Nature Metabolism 上发表了题为：Efficient elimination of MELAS-associated m.3243G mutant mitochondrial DNA by an engineered mitoARCUS nuclease 的研究论文。

该研究开发了一种线粒体靶向的ARCUS核酸酶——mitoARCUS，该核酸酶被设计用于特异性靶向和切割线粒体DNA（mtDNA）的致病性m.3243G点突变。

在含有95%突变m.3243G的线粒体DNA的细胞中，mitoARCUS可以消除所有含有突变的线粒体DNA，而不影响正常线粒体。这些正常线粒体DNA随后能够被细胞快速复制，以保持线粒体DNA拷贝数的稳定。通过消除突变线粒体DNA并允许正常线粒体DNA的重新复制，mitoARCUS驱动了突变线粒体向健康线粒体的转变，这一过程被称为异质性转换（shifting heteroplasmy）。

该研究还通过AAV递送mitoARCUS的系统给药，证明了mitoARCUS在体内编辑线粒体DNA的有效性。这些实验数据支持了mitoARCUS作为m.3243A>G相关线粒体疾病的体内基因编辑疗法的开发。

论文通讯作者、迈阿密大学米勒医学院的 Carlos Moraes 教授表示，迄今为止，线粒体疾病没有治愈性的治疗方法，基因编辑技术作为一种新方法，为线粒体疾病患者带来希望。 然而，许多基因编辑技术，特别是基于CRISPR的基因编辑技术，由于其复杂的多组件，一直无法有效地靶向突变的线粒体DNA，因此它们被认为不是线粒体疾病的有效治疗选择。mitoARCUS的简单性使其成为第一种不仅能够区分m.3243A>G点突变，还能有效地消除这一点突变的方法，能够使正常的线粒体DNA在细胞内重新复制并恢复功能。这一令人兴奋的进展有望为患有m.3243突变相关原发性线粒体疾病的患者带来治愈性治疗方法，并且ARCUS技术将来还可能被应用于研究和治疗其他线粒体疾病。

线粒体脑肌病伴高乳酸血症和脑卒中样发作（mitochondrial encephalopathy,lactic acidosis,and stroke-like episodes），简称MELAS综合征，是一种多系统线粒体疾病，也是最常见的线粒体脑肌病。其具体症状因人而异，但通常包括反复卒中样发作、脑病和乳酸积累。完全症状患者出现神经系统症状后的中位生存时间约为17年，平均死亡年龄为34.5±19岁，目前尚无治愈这种疾病的方法。

MELAS综合征涉及多个线粒体DNA（mtDNA）基因突变，包括MT-TL1、MT-TK、MT-TQ和MT-ND5等，其中最常见的突变位点是在编码线粒体tRNALeu(UUR)的MT-TL1基因中。特别是，mtDNA的3243位点的A>G点突变（m.3243A>G）导致了>80%的MELAS综合征。此外，除了MELAS综合征，m.3243A>G突变还与多种其他临床表型相关，包括听力丧失、偏头痛、肌肉无力和糖尿病等，总体而言，m.3243A>G突变的人群患病率估计高达1/400。

ARCUS是由Precision公司的科学家发现和开发的专有基因组编辑技术。它使用序列特异性的核酸酶来切割DNA，能够在细胞和生物体体内实现对DNA的敲除和敲入。ARCUS基于一种天然产生的基因组编辑酶I-CreI重新设计改造而来，I-CreI是在莱茵衣藻中进化，可在细胞DNA中进行高度特异性切割，并通过同源重组实现在切割位点的基因敲入。

此前，Precision公司已经将不同的ARCUS核酸酶应用在了敲除胆固醇代谢基因、转甲状腺素蛋白淀粉样纤维生成基因、灭活乙肝病毒，以及构建同种异体CAR-T细胞等领域。

2021年，他们发现了一种线粒体靶向的ARCUS核酸酶——mitoARCUS，可以通过腺相关病毒9型（AAV9）进行系统性递送，在小鼠体内消除线粒体DNA的m.5024C>T点突变【2】。

对于线粒体DNA的基因编辑而言，ARCUS相比ZFN、TALEN以及基于CRISPR的可编程基因编辑技术具有几点优势：ARCUS是一种单组分蛋白质，可以同时识别DNA和产生DNA双链断裂（DSB），其大小仅为约1100bp，可使用单个AAV载体递送，而且，可以对其优化底物识别相关氨基酸，以提高活性和特异性，从而产生高度特异性的ARCUS核酸酶。

基于ARCUS的这些特点，以及线粒体DNA中m.3243G点突变的流行，研究团队开发并优化了一种能够特异性识别和切割线粒体DNA的m.3243G点突变的mitoARCUS核酸酶。

添加了线粒体靶向序列（MTS）的mitoARCUS，可定位到线粒体

实验结果显示，mitoARCUS核酸酶具有高度特异性，能够高效切割携带m.3243G点突变的线粒体DNA，从而通过异质性转换（shifting heteroplasmy），驱动正常线粒体DNA的复制，恢复线粒体功能。这一过程没有任何因消除突变线粒体DNA产生的瞬时线粒体DNA耗竭相关毒性。

此外，研究团队还mitoARCUS核酸酶的细胞核基因脱靶编辑进行了表征，并确定除了添加线粒体靶向序列（MTS）外，还可以通过添加出核序列（NES）进一步保护细胞核基因组。

最后，研究团队开发了携带线粒体DNA的m.3243G点突变的新型小鼠模型，并通过AAV递送mitoARCUS的系统给药，证明了mitoARCUS在体内编辑线粒体DNA的有效性。这些实验数据支持了mitoARCUS作为m.3243A>G相关线粒体疾病的体内基因编辑疗法的开发。

Precision公司首席研究官 Jeff Smith 博士表示，对于线粒体疾病，ARCUS之所以成为如此优雅和简单的工具，是因为它是一个单组分蛋白质，可以识别和消除突变的线粒体DNA。这项新发表的论文进一步验证了ARCUS克服基于CRISPR的基因编辑技术的限制的能力，用于治疗线粒体疾病，并以高特异性消除突变的线粒体DNA，以改善整体线粒体功能。此外，这些数据突出了设计ARCUS核酸酶的能力，以区分突变和野生型DNA序列之间的单碱基变化，即使在非常高的剂量水平下也是如此。这些数据增强了我们对治疗原发性线粒体肌病的新疗法PBGENE-PMM的信心，我们期待在2025年将该疗法推进到临床试验阶段。