为什么有些病一发现就是晚期？Proteomics：外泌体+质谱，从血液中“抓”出疾病信号！

在疾病诊疗中，找到能早期预警、精准监测的生物标志物，是提升诊疗效率的关键。外泌体（Extracellular Vesicles，EVs）作为细胞分泌的膜囊泡，携带来源细胞的分子特征和病理状态信息，本应是理想的生物标志物候选者。但血浆成分复杂，EVs丰度低且易与脂蛋白、杂蛋白共纯化，让其开发陷入困境。

近日，Proteomics发表的一项研究Challenges and Opportunities in State-of-the-Art Proteomics Analysis for Biomarker Development From Plasma Extracellular Vesicles，为这一难题提供了新思路——无需执着于EVs的绝对纯度，通过优化组成表征与质谱技术分析，就能高效推进其作为生物标志物的开发。

研究首先证实了EVs的生物标志物潜力：恰加斯病患者血浆EV中，研究者检测到人类白细胞抗原I类（HLA I类）、12种克氏锥虫蛋白，还发现α-半乳糖残基与转唾液酸酶可作为标志物；神经退行性疾病领域，脑来源EV的APLP1蛋白能实现早期诊断，帕金森病高危人群的EV相关α-突触核蛋白可作诊断指标，血浆EV中的TDP-43水平与3R/4R tau比例还能区分额颞叶痴呆与肌萎缩侧索硬化；1型糖尿病中，高风险人群血浆EV的PD-L1水平升高且与残存β细胞功能相关，小鼠模型中更发现约300种β细胞特异性蛋白仅存在于EV中；癌症领域，肿瘤来源EV的GPC1可助力胰腺癌早诊，结直肠癌患者血浆中纤维蛋白原α链阳性EV能区分健康人群，乳腺癌EV的8蛋白特征则可鉴别转移与否。

图1：包含因组成变化而可能成为生物标志物的蛋白质的外泌体（EV）示意图，这些蛋白质可反映病理状态

不过，EVs开发面临三大核心挑战：一是血浆中EVs易与脂蛋白等杂质共纯化，多次纯化虽提升纯度，却可能仅回收1%初始EVs；二是特定细胞来源EVs（如胰岛β细胞、脑细胞来源）占比低，需2mL左右血浆，不利于儿童等特殊人群研究；三是现有纯化方法耗时费力，难以满足大规模临床样本分析需求。目前常用的EVs纯化方法各有优劣：离心法易共沉淀白蛋白，体积排阻色谱（SEC）无法完全分离脂蛋白，免疫亲和法产量低，电荷法需应对样本电荷差异，新兴的Mag-Net法仅需100μL血浆且可自动化，但仍需优化；所有方法都需在纯度、产量与可操作性间权衡。

图2：用于蛋白质组学分析的外泌体（EV）纯化方法

研究团队提出关键突破：无需追求EVs的绝对均一性，转而通过元分析细化EVs组成更可行。他们开发的元分析方法，基于不同纯化方法的杂质-EV比例差异，将EV蛋白与杂质蛋白聚类区分，验证发现SEC法的杂质-EV比例最优，且能通过免疫金电镜、ExoView技术验证EV蛋白（如CD9、CD63）。同时，质谱技术（MS）的进步为复杂样本分析提供支撑：非靶向的DIA（数据非依赖采集）和DDA（数据依赖采集）可单次鉴定超10000种蛋白，DIA还能减少低丰度蛋白检测偏差；靶向的SRM（选择反应监测）和PRM（平行反应监测）可精准定量目标蛋白，如SRM已用于验证前列腺癌尿EV标志物；杂交DIA-PRM法则结合无偏分析与靶向定量优势。

图3：基于质谱（MS）的富集但复杂样品中外泌体（EV）蛋白质组学研究视角

机器学习（ML）进一步助力生物标志物筛选：针对三阴性乳腺癌，结合LsBoost、卷积神经网络与支持向量机的ML算法，从100例患者与30例对照中筛选出3种EV蛋白，检测灵敏度达100%、特异性80%；另一项研究用LASSO方法筛选蛋白，使不同肿瘤类型EV的鉴别准确率从49.15%提升至91.68%。未来研究将重点优化EVs组成验证技术、提升小样本回收率（如SEC与Mag-Net法自动化），结合纳米滴处理技术（如NanoPOTS）与高灵敏度质谱（如Thermo Astral），加速EVs生物标志物的临床转化。

综上，这项研究打破了“EVs必须绝对纯化才能作为生物标志物”的传统认知。通过“组成细化+质谱分析+AI助力”的新思路，不仅解决了EVs开发中的纯化难题，还为多种疾病的早期诊断、病情监测提供了新方向。随着技术不断优化，EVs有望成为临床诊疗中高效、精准的生物标志物，为改善患者预后、提升医疗水平注入新动力。（生物谷Bioon.com）

参考文献：

Dakup PP, Ludovico ID, You Y, et al. Challenges and Opportunities in State-of-the-Art Proteomics Analysis for Biomarker Development From Plasma Extracellular Vesicles. Proteomics. Published online September 16, 2025. doi:10.1002/pmic.70036