刘如谦团队开发双AAV载体，首次实现体内多器官高效先导编辑

2019年10月21日，刘如谦团队在 Nature 发表论文【2】，开发了一种全新的精准基因编辑工具——先导编辑（Prime Editing），无需依赖DNA模板便可有效实现所有12种单碱基的自由转换，而且还能有效实现多碱基的精准插入与删除。该工具“理论上可以修复75000种已知致病性人类遗传变异的89%”。

此后几年时间里，全世界各地数百个实验室纷纷证实了先导编辑的强大性，刘如谦也围绕该技术创建了新公司 Prime Medicine，该公司于2022年10月在纳斯达克上市。

但先导编辑（Prime Editing）也面临着一个重要挑战，相比其他基因编辑工具，先导编辑的效率还是太低了。此前在活体动物中进行的研究显示，先导编辑的体内编辑效率大约只有5%，这个效率对大多数疾病难以产生实际治疗效果。

2023年5月4日，刘如谦团队在 Nature Biotechnology 期刊发表了题为：Efficient prime editing in mouse brain, liver and heart with dual AAVs 的研究论文。

该研究开发了一种优化的双AAV递送系统，实现了前所未有的高效体内先导编辑，在小鼠大脑中实现了高达42%的编辑效率，在肝脏中的编辑效率高达46%，将体内先导编辑的效率提高了大约10倍，为遗传疾病的研究和治疗打开了大门。

先导编辑系统由两部分组成：一个含有DNA切口酶（nickase）和工程逆转录酶（RT）的融合蛋白；另一个是PE向导RNA——pegRNA。pegRNA包含一个指定目标位点的间隔体（spacer），一个单向导RNA（sgRNA）支架和一个编码所需编辑的3'端扩展。

该3'端扩展包含一个引物结合位点（PBS），它是互补的一部分DNA原间隔和一个RT模板，编码所需的编辑和下游基因组序列。PE系统与靶位点结合后，将含有PAM序列的DNA链切出，切出的DNA链碱基对与pegRNA中的PBS结合，从而将反转录的编辑序列直接引到靶DNA位点。新合成的编辑DNA的3'端随后通过细胞DNA修复途径分解，最终在目标位置进行所需的编辑。

先导编辑系统工作示意图

到目前为止，临床上只有两种递送载体可以将基因编辑工具递送到患者体内——腺相关病毒（AAV）和脂质纳米颗粒（LNP），一些制药公司开始放弃AAV载体，部分原因是AAV会在一些患者体内引发抗体，导致无法二次给药。但对于基因编辑疗法来说，这可是并不是什么问题，因为患者基因编辑通常是一次性治愈。

刘如谦表示，目前有许多正在研究中的递送技术，包括脂质纳米颗粒（LNP）、工程类病毒载体（eVLP）等。而AAV是经过临床验证的将大分子递送到各种组织（包括心脏和大脑）的有高效的载体，而且具有很好的安全性。

然而，先导编辑系统太大了（6.3kb），远超AAV的装载极限（4.7kb），因此，需要将编码先导编辑器的DNA拆分到两个AAV载体中，每个AAV表达不同的片段。这两个片段需要经过特别设计，分别表达和翻译的蛋白片段才能自发聚集在一起并组装成完整的先导编辑蛋白。此外，先导编辑向导RNA（pegRNA）和引导切割的sgRNA也要装载到AAV中。

在这项研究中，研究团队报道了在小鼠多个不同器官中进行高效体内向导编辑的内含子断裂PE-AAV载体的开发、优化和应用。结果显示，在先导编辑蛋白的1024位点处断裂后，蛋白重新组装和编辑的效率最高。在此基础上，研究团队优化了先导编辑蛋白、pegRNA及AAV基因组元件，进而开发了v3em PE-AAV递送系统。

使用这一递送系统，研究团队在小鼠中进行了体内先导编辑，结果显示，在小鼠的大脑、肝脏和心脏中分别实现了42%、46%和11%的编辑效率，这达到了治疗所需的编辑水平。据悉这也是首次对出生后的动物的大脑和心脏进行先导编辑，而且编辑效率远超之前在肝脏中AAV介导的体内先导编辑。

接下来，研究团队使用v3em PE3-AAV递送系统在小鼠体内进行了构建感兴趣的疾病保护性基因突变的实验，包括改变阿尔茨海默病患病风险的APOE3 R136S突变（携带该基因突变的人不易患阿尔茨海默病），以及改变低密度脂蛋白胆固醇水平和冠状动脉疾病风险的PCSK9 Q155H突变（在人类中是PCSK9 Q152H突变，携带该突变的人类不易患冠状动脉疾病）。

总的来说，该研究开发并优化了一种用于体内递送先导编辑的双AAV载体系统，在小鼠的多个器官中实现了迄今最高效力的体内先导编辑效率，为先导编辑的基础研究和疗法开发奠定了坚实的基础。

此外，之前的研究认为，基因编辑技术通常在新生和年轻小鼠上的效果更好，其中部分与递送有关，还有部分与目标细胞的增殖和状态有关。而这项研究在老年小鼠中同样进行了有效的编辑和治疗，这意味着基因编辑疗法将不局限于新生儿或非常年轻的患者，对于一些老年人高发的疾病来说（例如阿尔茨海默病、冠状动脉疾病），是一个新的治疗机会，将帮助更多的疾病类型和患者群体带来希望。

研究团队表示，这项研究将先导编辑成功应用于小动物体内的基因编辑，很快将推到大型动物体内，最终推进到人类临床试验，接下来几年的我们将见证先导编辑激动人心的进展。

值得一提的是，2023年4月，刘如谦团队在 Nature Biomedical Engineering 期刊发表了题为：Ex vivo prime editing of patient haematopoietic stem cells rescues sickle-cell disease phenotypes after engraftment in mice 的研究论文【2】。

该研究在体外对人类镰状细胞病患者的造血干细胞进行先导编辑，在移植给小鼠后，成功挽救了小鼠的镰状细胞病表型。此外，该治疗策略具有高编辑效率、低频indel副产物和最小的脱靶编辑水平。

刘如谦教授表示，这项研究表明，先导编辑后的血液干细胞保持了它们在骨髓中定植和重新扩增填充的全部能力，将先导编辑的“搜索-替换”能力应用于血液干细胞，增加了使用先导编辑技术治疗涉及血细胞的广泛疾病的可能性。