Cell：核糖体“撞车”引发的基因命运！m⁶A调控mRNA降解的意外发现！

“刹车”与“油门”：m⁶A降解依赖于“开足马力”的翻译

首先，研究人员想知道，m⁶A导致的mRNA降解是否依赖于mRNA的翻译过程？

他们使用了一种叫做TimeLapse-seq的技术，可以追踪mRNA的合成和降解速率，从而测量mRNA的半衰期（half-life）。研究人员在小鼠胚胎干细胞（mESC）中，使用翻译抑制剂依米丁（emetine）处理细胞，抑制mRNA的翻译。他们发现，依米丁处理后，mRNA的半衰期普遍增加了，这表明在正常条件下，许多mRNA的降解是依赖于翻译的。

有趣的是，这种依米丁引起的mRNA半衰期增加程度，与mRNA上的m⁶A总量密切相关。m⁶A总量越多的mRNA，其半衰期在翻译抑制后增加得越显著，变得越稳定。

为了确认这个现象确实与m⁶A有关，研究人员在Mettl14敲除的小鼠胚胎干细胞中进行了同样的实验。Mettl14是催化mRNA上m⁶A形成的关键酶，Mettl14敲除后细胞内的m⁶A水平极低。结果显示，在Mettl14敲除细胞中，依米丁导致的mRNA稳定化效应大大减弱了。在野生型细胞中，依米丁处理使mRNA半衰期中位数增加了0.32倍，而在Mettl14敲除细胞中仅增加了0.05倍，差异巨大。

这强有力地证明，m⁶A是翻译依赖性mRNA降解的主要驱动力。换句话说，只有当核糖体在mRNA上“开足马力”进行翻译时，m⁶A才能有效地促进mRNA的降解。

核糖体的“惊魂时刻”：m⁶A引发剧烈“卡壳”

既然m⁶A介导的降解依赖于翻译，那么m⁶A是否会直接影响核糖体的翻译过程呢？特别是核糖体在读取含有m⁶A的密码子时会发生什么？

研究人员使用了OTTR核糖体足迹测序（ribosome footprint profiling）技术，这是一种能够高灵敏度地捕捉核糖体在mRNA上位置的方法。他们分析了核糖体在mRNA上不同位置的“足迹”，特别关注核糖体A位点（A-site）位于含有m⁶A的密码子上的情况。通过计算核糖体在m⁶A位点及其周围区域的相对丰度（使用标准化Z分数衡量），研究人员构建了核糖体“卡壳指数”（stalling index），用来量化核糖体在某个位点停留的倾向。

结果令人震惊：在mRNA的编码区（coding sequence, CDS）中，核糖体在含有m⁶A的位点会发生剧烈“卡壳”，其“卡壳”程度比紧邻的非m⁶A对照位点高出约650%！ 这个效应比之前一些研究报道的非甲基化对照位点约50%-60%的“卡壳”增加要显著得多，这可能得益于研究人员能够更精确地定位m⁶A位点和更高灵敏度的检测方法。

更重要的是，这种剧烈的核糖体“卡壳”效应完全依赖于m⁶A的存在。在Mettl14敲除细胞中，这些原本会引起剧烈“卡壳”的位点就几乎不引起核糖体富集了。这表明，m⁶A本身是导致核糖体剧烈“卡壳”的直接原因，而不是这些位点原本就有的“卡壳”倾向。

研究还发现，m⁶A所在的具体密码子序列（codon context）也会影响“卡壳”的强度。某些m⁶A密码子（如GA-m⁶A和AA-m⁶A）比其他m⁶A密码子引起更强的“卡壳”。

那么，“卡壳”强度与mRNA降解有什么关系呢？研究人员计算了不同m⁶A密码子引起核糖体“卡壳”的程度与它们对m⁶A介导mRNA降解效果的关联。他们发现，引起核糖体“卡壳”越剧烈的m⁶A密码子，往往也导致mRNA降解越有效，两者之间存在强烈的正相关（相关系数R=0.74）。 作为对照，非甲基化的相似密码子则显示出微弱的负相关。

为了进一步验证，研究人员构建了报告基因，在其中插入了容易引起高“卡壳”的GA-m⁶A密码子簇，或引起低“卡壳”的A-m⁶AC密码子簇。实验显示，含有高“卡壳”GA-m⁶A密码子的报告基因，其mRNA稳定性显著低于含有低“卡壳”A-m⁶AC密码子的报告基因。并且这种稳定性差异在Mettl14敲除细胞中消失了。

这些结果都明确指向：mRNA上的m⁶A通过诱导核糖体剧烈“卡壳”，从而启动了m⁶A介导的mRNA降解。

一“卡”引发“追尾”：核糖体碰撞与独特“足迹”

如此剧烈的核糖体“卡壳”，很自然会让人想到是否会导致后续核糖体的“追尾”或“撞车”（collision）。多个核糖体在一个mRNA上进行翻译，如果前方的核糖体突然停下，后方的核糖体就会追上来，形成“二聚体”（disome）或“三聚体”（trisome）。

研究人员首先在体外模拟了翻译过程，发现含有m⁶A的mRNA在翻译时确实会产生核糖体“二聚体”甚至“三聚体”，而没有m⁶A的mRNA则只产生单个核糖体（monosome）。并且这种“撞车”依赖于翻译起始因子eIF4E的存在。

在活细胞中进行的核糖体足迹测序也证实了这一点：核糖体“二聚体”的足迹在m⁶A位点附近显著富集。 在Mettl3（m⁶A合成酶的另一关键组分）敲除细胞中，通过蔗糖密度梯度离心定量核糖体“二聚体”，发现其数量比野生型细胞减少了约40%。

更令人兴奋的是，研究人员发现m⁶A位点附近的核糖体“二聚体”具有一种独特的构象。通过分析“二聚体”足迹相对于m⁶A位点的精确位置，他们发现，与通常在终止密码子处形成的、足迹末端位于终止密码子下游14-21个核苷酸的“二聚体”不同，m⁶A诱导的“二聚体”中，位于前方的“卡壳”核糖体的足迹末端明显被截短，只在m⁶A位点下游约4-8个核苷酸处。 这种截短现象在单个“卡壳”的核糖体足迹中没有观察到，表明它确实是核糖体“撞车”后才出现的。

“追尾”招募“识别器”：碰撞促进YTHDF蛋白“到位”

核糖体“撞车”是否是连接“卡壳”与m⁶A降解的关键步骤？为了验证这个想法，研究人员利用敲低ASCC3蛋白的方法增加了“撞车”核糖体的持久性。ASCC3是ASC-1复合体的一个亚基，这个复合体能够解聚“撞车”的核糖体。敲低ASCC3会阻止“二聚体”的解聚，让“撞车”核糖体在mRNA上停留更长时间。实验发现，ASCC3敲低显著增强了m⁶A介导的mRNA降解效果。 这强烈暗示，“撞车”核糖体的持久性，即长时间的“连环追尾”，促进了m⁶A介导的mRNA降解。

m⁶A介导的mRNA降解通常需要YTHDF家族蛋白的参与。这些蛋白是m⁶A的“阅读器”，它们结合m⁶A标记后，会招募mRNA降解机器。那么，“撞车”的核糖体是否会促进YTHDF蛋白与m⁶A的结合呢？

研究人员发现，使用依米丁抑制翻译导致的mRNA稳定化，在YTHDF蛋白三重敲除（YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3）的细胞中显著减弱。这表明，翻译依赖的m⁶A-mRNA降解路径与YTHDF蛋白介导的路径高度重叠，它们很可能在同一条通路中协同工作。

为了直接检测YTHDF蛋白与“撞车”m⁶A位点的关系，研究人员使用YTHDF2的iCLIP技术（一种高精度地绘制蛋白-RNA相互作用图谱的技术）分析了YTHDF2蛋白的结合位点。他们发现，在发生核糖体“二聚体”的m⁶A位点，YTHDF2蛋白的iCLIP结合信号明显更高，而那些没有“二聚体”的m⁶A位点，YTHDF2结合信号较低。

此外，先前的研究表明YTHDF蛋白可以与核糖体（特别是40S亚基的RACK1）以及18S rRNA的Helix 16区域相互作用。这项研究也证实了YTHDF2与RACK1的相互作用依赖于活跃翻译或80S核糖体结构，并且在Mettl14敲除细胞中减少。有意思的是，18S rRNA的Helix 16区域恰好位于核糖体“撞车”时形成的界面（collision interface）区域。

这些证据共同指向一个模型：核糖体在m⁶A位点“卡壳”并引发“撞车”，形成的独特“撞车”构象可能为YTHDF蛋白的招募提供了便利。 YTHDF蛋白可能通过与“撞车”核糖体界面或直接与m⁶A本身（在“卡壳”核糖体的A位点）相互作用，从而稳定地结合在m⁶A位点，进而招募降解机器启动mRNA降解。

逆境中的“逆袭”：应激下m⁶A-mRNA“转危为安”

我们回到开头提到的问题：m⁶A标记的mRNA编码着许多应激响应基因，在细胞应激时它们水平需要快速升高。这如何与m⁶A促进降解的功能相协调呢？

细胞在面对多种应激（如氨基酸饥饿、内质网应激）时，一个普遍的响应是抑制整体的蛋白质翻译速率，从而节约能量和资源。研究人员猜想，这种应激导致的翻译抑制，是否会影响m⁶A介导的mRNA降解？

他们模拟了细胞应激，比如氨基酸剥夺。氨基酸剥夺确实导致了整体翻译速率的显著下降，在野生型细胞中翻译速率下降了约66%，在Mettl3敲除细胞中下降了约77%。 在这种翻译被抑制的状态下，研究人员再次测量了mRNA的半衰期。

结果显示，氨基酸剥夺显著稳定了含有m⁶A的mRNA，并且这种稳定化效应的程度与mRNA上的m⁶A水平成正比。 而在m⁶A水平极低的Mettl3敲除细胞中，这种应激诱导的稳定化效应也大大减弱了。类似的现象也在内质网应激诱导剂（如图尼卡霉素，tunicamycin）处理后观察到，尽管稳定化效果不如氨基酸剥夺明显。

这说明了一个关键的机制：细胞应激诱导的翻译抑制，降低了核糖体的移动速率，从而减少了核糖体在m⁶A位点的“卡壳”和随后的“撞车”。“撞车”减少了，YTHDF蛋白的招募减少，m⁶A介导的mRNA降解也就减弱了。 这样一来，那些在正常条件下因m⁶A标记而被快速降解的mRNA，在应激发生时由于翻译抑制而得以稳定下来，其水平迅速升高。

模式图（Credit: Cell）

核心观点：核糖体是调控m⁶A代谢的“第一道防线”

那么，应激时m⁶A-mRNA的稳定化升高，对细胞有什么好处呢？研究人员注意到，许多需要在应激时表达的基因（如自噬相关基因）都富含m⁶A标记，并且它们在Mettl3敲除细胞中（m⁶A介导降解受阻）表现出显著的稳定性增加。

自噬（autophagy）是一种细胞在营养饥饿等应激条件下，通过“吃掉”自身损伤或不需要的组分来维持生存的关键过程。研究人员通过检测自噬的关键标志物（如ATG12、ULK1）发现，在Mettl3敲除、m⁶A介导降解受阻的细胞中，即使在氨基酸充足的正常条件下，也已经观察到了自噬水平的升高。在这些细胞中再进行氨基酸剥夺，自噬水平也只轻微增加。

这强烈暗示：仅仅是抑制m⁶A介导的mRNA降解，就足以引发自噬等应激响应。 细胞巧妙地利用翻译抑制这个“开关”：在平时，让核糖体“开足马力”翻译，m⁶A标记就像是“刹车”信号，促使对应的mRNA被降解，保持低水平表达；而在应激时，普遍抑制翻译，核糖体移动缓慢，“刹车”信号不被有效响应，m⁶A-mRNA得以稳定，并快速表达，从而启动自噬等关键的应激响应通路，帮助细胞渡过难关。

这项研究揭示了一个全新的m⁶A功能模型：核糖体是细胞感知m⁶A标记的“第一道防线”！ 它不仅仅是基因蓝图的执行者，更是动态调控m⁶A-mRNA代谢的关键“传感器”。核糖体在m⁶A位点的“卡壳”和“撞车”，是连接翻译动力学与m⁶A介导的mRNA降解之间的重要信号。细胞应激时通过普遍抑制翻译，巧妙地“绕过”这个降解通路，确保关键的应激响应基因能够被及时大量表达。

这项研究不仅加深了我们对m⁶A如何调控基因表达的理解，更揭示了核糖体在其中的核心传感作用。未来的研究，特别是利用冷冻电镜（cryo-EM）技术解析含有m⁶A的“撞车”核糖体与YTHDF蛋白相互作用的精确结构，将为我们带来更多激动人心的发现。

所以，下一次当你听到“m⁶A”时，不妨想想那些在mRNA上“卡壳”、“追尾”，默默影响着基因命运的“撞车”核糖体吧！