《癌细胞》：科学家分析了近130万个细胞，发现非小细胞肺癌具有极端的免疫多样性！

肺癌是全球发病率和死亡率位居前列的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌（NSCLC）约占肺癌患者的80%以上，不仅存在高度侵袭性和异质性，而且还具有复杂的组织学亚型和明显的突变特征[1]。

单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的进步，使得高度异质性的肿瘤微环境能够被深入剖析。但是众多scRNA-seq研究的主要局限是，每个研究的样本量都是有限的，同时还缺乏基因组数据和长期随访数据。这些因素阻碍了对肿瘤微环境生物异质性、治疗耐药性和生存结局的全面分析。

白细胞是NSCLC肿瘤微环境的重要组成细胞类型。过去针对大多数肿瘤的流式细胞术和组织学分析表明，中性粒细胞在瘤内驻留白细胞中占比8%-20%[2,3]。

但是近年来，关于NSCLC的scRNA-seq数据却极少提及中性粒细胞。所以，研究中性粒细胞在NSCLC 肿瘤微环境中的作用，具有极其重要的意义。

近期，来自奥地利因斯布鲁克医科大学的Zlatko Trajanoski和Andreas Pircher研究团队合作在Cancer Cell上发表了重要的研究成果[4]。他们发现，NSCLC的肿瘤微环境中存在功能特性不同的组织驻留中性粒细胞（TRNs）亚群。更重要的是，TRNs的基因标记与免疫检查点抑制剂治疗的不良预后相关。

论文首页截图

研究团队收集了来自19项研究和21个数据集的scRNA-seq公开数据，结合团队自己的NSCLC数据集（UKIM-V），他们开发并整合出一个全面的、具有大规模样本量的NSCLC单细胞核心图谱。

核心图谱包括212名NSCLC患者和86名对照者的转录组数据，以及196个肿瘤样本和168个非肿瘤对照样本。在212名NSCLC患者中，156人为肺腺癌（LUAD），41人为肺鳞状细胞癌（LUSC）。

在这个NSCLC核心图谱中，他们发现中性粒细胞群仅占所有细胞的1.5%，但是图谱里78%的中性粒细胞来自UKIM-V数据集，其中中性粒细胞分别占UKIM-V所有细胞的12%和所有白细胞的18%，与他们的流式细胞分析数据一致。

中性粒细胞在循环中的半衰期仅为7-10小时[5]，所以表达的mRNA分子量极低。通过整合六种不同的测序平台，研究团队发现，BD Rhapsody平台捕获的mRNA分子数量要丰富得多，因此可能更适合检测低mRNA含量的细胞。

为了深入分析中性粒细胞的转录组特征，研究团队利用BD Rhapsody平台测序的UKIM-V队列数据进一步分析。他们发现，LUSC中中性粒细胞比例明显较高，而LUAD中巨噬细胞、CD4 T细胞、2型肺泡细胞、过渡型棒状细胞/2型肺泡细胞（transitional club/AT2）更为丰富。

研究的总体流程和细胞类型

接下来，他们根据患者肿瘤微环境浸润模式对NSCLC患者进行分层，发现了四种不同的肿瘤免疫表型：免疫荒漠型（没有明显的免疫细胞浸润，但肿瘤细胞比例高）；B细胞优势型（主要为B细胞，浆细胞，肥大细胞）；髓系细胞优势型（主要为巨噬细胞、单核细胞) ；T细胞优势型（主要为CD8 T细胞，CD4 T细胞，调节性T细胞）。不同免疫表型也表现出具有差异性的细胞因子信号特征。

不同肿瘤免疫表型的细胞因子信号特征

早期研究发现LUAD和LUSC也呈现出不同的免疫景观（landscapes），前者以炎症状态为主，后者以伤口愈合状态为主[6]。

为了分析肿瘤微环境中细胞之间配体-受体互作的在组织学中的差异，通过构建细胞-细胞通信网络。

他们发现，LUAD以KDR（VEGFR2，血管内皮细胞生长因子受体2）-VEGFA（血管内皮生长因子A）通信上调为特征，通过促进血管生成，开启免疫抑制信号，而LUSC则以SPP1（分泌型磷蛋白1）和JAG-NOTCH信号通路上调为主要特征，前者促进肿瘤转移，后者通过募集中性粒细胞调节肿瘤免疫微环境。

细胞互作分析

通过结合分析关联的TCGA队列数据的细胞类型转录组与生存数据之间的关系，他们发现，肿瘤B细胞的富集度与NSCLC患者的良好预后成正相关，而中性粒细胞则呈负相关。对CD8 T细胞亚型的分析显示，幼稚CD8 T细胞与良好预后呈正相关（下图G）。

TCGA数据中细胞组成和生存率的关系

接下来，研究人员进一步鉴定了NSCLC中TRNs的异质性细胞亚群。结果发现，肿瘤相关中性粒细胞（TANs）和邻近正常组织相关中性粒细胞（NANs）具有不同的表达谱特征，并且中性粒细胞是肿瘤微环境中VEGFA的主要来源，印证了TRNs重要的促血管生成作用。

他们还注意到，TANs中凝集素型氧化低密度脂蛋白受体1（LOX-1）表达升高，肿瘤组织中存在较多的LOX-1⁺细胞浸润，但在匹配的相邻的正常肺组织中未发现LOX-1⁺细胞浸润，说明LOX-1可能是一种特异性的TANs标记物。

为了深入解析TRNs不同亚群的异质性，研究团队继续对图谱中TRNs进行聚类分析，鉴定出了4个TAN亚群和3个NAN亚群。

值得注意的是，TAN-2亚群CD274（PD-L1）/PDCD1（PD-1）信号通路显著上调，提示了TAN对CD8 T细胞的免疫抑制作用，这与过去报道的中性粒细胞的富集与抗PD-1/PD-L1治疗无应答有关的结果一致[8]。

为了确定TRNs在NSCLC患者中的预后价值，研究团队分析NSCLC患者治疗前肿瘤的RNA-seq数据，这些患者经历了抗PD-L1抗体或化疗药单药治疗。结果显示，TRN基因标记与抗PD-L1治疗应答和生存预后呈明显负相关（p=0.003），但在化疗组中并不显著。

TRN基因标记与免疫治疗应答和预后的关系

总的来说，这个研究在单细胞水平上对NSCLC肿瘤微环境进行了全面剖析，不仅着重分析了数据稀缺的中性粒细胞群，对肿瘤微环境中具有不同功能特性的TRNs亚群进行深入表征，而且还整合了基因组数据以及长期随访数据，揭示了中性粒细胞与免疫治疗抵抗和不良生存结局的关联，为后续开发中性粒细胞耗竭剂奠定了基础。

参考文献：

[1] Chen Z, Fillmore CM, Hammerman PS, Kim CF, Wong KK. Non-small-cell lung cancers: a heterogeneous set of diseases [published correction appears in Nat Rev Cancer. 2015 Apr;15(4):247]. Nat Rev Cancer. 2014;14(8):535-546. doi:10.1038/nrc3775

[2] Eruslanov EB, Bhojnagarwala PS, Quatromoni JG, et al. Tumor-associated neutrophils stimulate T cell responses in early-stage human lung cancer. J Clin Invest. 2014;124(12):5466-5480. doi:10.1172/JCI77053

[3] Kargl J, Busch SE, Yang GH, et al. Neutrophils dominate the immune cell composition in non-small cell lung cancer. Nat Commun. 2017;8:14381. Published 2017 Feb 1. doi:10.1038/ncomms14381

[4] Salcher S, Sturm G, Horvath L, et al. High-resolution single-cell atlas reveals diversity and plasticity of tissue-resident neutrophils in non-small cell lung cancer [published online ahead of print, 2022 Oct 27]. Cancer Cell. 2022;S1535-6108(22)00499-8. doi:10.1016/j.ccell.2022.10.008

[5] Shaul ME, Fridlender ZG. Tumour-associated neutrophils in patients with cancer. Nat Rev Clin Oncol. 2019;16(10):601-620. doi:10.1038/s41571-019-0222-4

[6] Thorsson V, Gibbs DL, Brown SD, et al. The Immune Landscape of Cancer [published correction appears in Immunity. 2019 Aug 20;51(2):411-412]. Immunity. 2018;48(4):812-830.e14. doi:10.1016/j.immuni.2018.03.023

[7] Zilionis R, Engblom C, Pfirschke C, et al. Single-Cell Transcriptomics of Human and Mouse Lung Cancers Reveals Conserved Myeloid Populations across Individuals and Species. Immunity. 2019;50(5):1317-1334.e10. doi:10.1016/j.immuni.2019.03.009

[8] Kargl J, Zhu X, Zhang H, et al. Neutrophil content predicts lymphocyte depletion and anti-PD1 treatment failure in NSCLC. JCI Insight. 2019;4(24):e130850. Published 2019 Dec 19. doi:10.1172/jci.insight.130850