Nat Chem Biol丨尹胜/郭剑平团队揭示先导化合物DP通过靶向APOL2治疗肝纤维化的机制

通过高内涵筛选发现了一类强效抗HSCs激活的惕各烷型二萜（5/7/6/3环系碳骨架），其中化合物DP为活性最优化合物。进一步研究发现，DP可以抑制TGF-1诱导的LX-2（人肝星状细胞系）和JS-1（小鼠肝星状细胞系）细胞激活，在低浓度下与阳性药物吡非尼酮（Pirfenidone，PFD）在高浓度下的效果相当。此外，DP可以抑制小鼠原代肝星状细胞自激活，以及抑制LX-2 3D细胞球中-平滑肌肌动蛋白（-smooth muscle actin，-SMA）的表达。以上结果表明DP是强效抗肝纤维化的先导化合物。

通过小鼠肝纤维化模型对DP进行体内药效学评价，结果显示口服给予DP可以剂量依赖性地减轻肝脏炎症浸润水平、肝细胞损伤水平和纤维化程度，且对小鼠的重要脏器和膝关节骨结构无明显毒性。值得注意的是，DP在20 mg/kg剂量下的治疗效果与PFD在200 mg/kg剂量下的治疗效果相当。表明DP是一个高活性且安全的先导化合物。

基于先导化合物DP合成了具有光亲和标记和点击化学反应基团的探针DP-PT（活性与DP相当），通过胶内荧光扫描、靶点垂钓、竞争性结合实验、体外蛋白结合实验、细胞热转移实验和荧光共定位分析证实DP的作用靶点为APOL2，且DP不与APOL1结合，表明DP具有一定的选择性。

通过APOL2片段化蛋白pull-down检测、光交联质谱分析、分子对接模拟和蛋白点突变验证实验，发现DP主要作用于APOL2蛋白的186−266 aa区域，其中N212和V216为关键氨基酸结合位点。

通过临床肝纤维化病人数据库、人体和动物肝脏中APOL2蛋白表达量分析，发现与正常肝脏组织相比，APOL2在纤维化肝脏组织中的表达量显著升高，且与疾病分期进展以及-SMA表达水平呈正相关关系。此外，通过特定细胞标记物与人类和小鼠纤维化肝脏组织中APOL2进行共染色实验，发现APOL2主要在活化的HSCs中高表达。通过调控LX-2细胞中APOL2表达实验发现，敲低APOL2能显著抑制TGF-1诱导的纤维化指标上调，而过表达APOL2能够在没有TGF-1刺激的情况下诱导纤维化指标上调。基于以上结果，利用CRISPR/Cas9技术构建了Apol2全身敲除（Apol2^-/-）小鼠，并且在体内研究了Apol2敲除对肝纤维化的影响，结果显示Apol2敲除可以显著抑制CCl₄诱导的小鼠肝纤维化进展，且无明显的器官毒性。以上结果表明APOL2与肝纤维化的发生发展密切相关，可以作为治疗肝纤维化的潜在靶点。进一步研究发现，DP在APOL2敲低的LX-2细胞中不能进一步降低纤维化水平，但可以抑制APOL2过表达引起的促纤维化效果。重要的是，与过表达APOL2^WT（野生型APOL2）相比，过表达APOL2^2A（N212和V216双突变的APOL2）可以废除DP的抗纤维化活性。以上结果表明DP依赖于APOL2发挥抗肝纤维化功效。

初步机制研究发现DP处理或者敲低APOL2不影响经典的TGF-/Smad信号通路。通过免疫沉淀质谱、免疫荧光共定位、外源表达结合免疫沉淀实验，发现Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 2（SERCA2），一种内质网（Endoplasmic reticulum，ER）定位的Ca²⁺泵，可以与APOL2相互作用，且APOL2的N端负责与SERCA2结合。进一步研究发现，在TGF-1的刺激下，APOL2通过抑制SERCA2对ER Ca²⁺的螯合功能，进而激活PERK介导的ER应激通路。DP则可以靶向APOL2，阻断APOL2与SERCA2结合，恢复SERCA2的功能，抑制肝纤维化的发生。通过RNA-seq和基因调控实验，发现APOL2-ER应激的下游效应因子是HES1，且DP或APOL2敲低的抗纤维化作用是由HES1介导的。动物实验也显示DP给药或Apol2敲除可以抑制PERK-HES1信号通路。以上结果表明DP通过抑制APOL2-SERCA2-PERK-HES1轴发挥抗肝纤维化功效。

综上所述，该研究不仅鉴定DP为首个APOL2抑制剂，而且确认APOL2可以作为治疗肝纤维化的潜在新靶标。由于APOL2可能在其他器官纤维化以及其他疾病中发挥重要的调节作用，DP也可能成为未来基于APOL2的药物开发的有效工具。