Nature：告别“一种药治一种病”——重写单个tRNA基因，PERT策略有望通过“通用补丁”治疗数千种遗传病

在ClinVar数据库记录的致病等位基因中，约有 24% 是由无义突变（nonsense mutations）引起的。这些突变在基因序列中引入了提前终止密码子（PTC），导致核糖体在蛋白质合成完成之前就“紧急刹车”，产生截短的、通常无功能的蛋白质，并可能触发无义介导的mRNA降解（NMD）。

理论上，抑制性tRNA（sup-tRNA）是这类突变的完美克星。sup-tRNA拥有与终止密码子互补的反密码子，能够引导核糖体通读PTC。然而，该疗法迟迟未能转化的核心痛点在于“很难把握度”：外源过表达sup-tRNA往往伴随着严重的毒性，可能导致全基因组范围内的正常天然终止密码子（NTC）被错误通读。

David Liu团队提出的 PERT（先导编辑介导的提前终止密码子通读）策略，巧妙之处在于“内源置换”而非“外源添加”。利用人类基因组中418个高置信度tRNA基因的冗余性，牺牲其中一个拷贝将其转化为sup-tRNA。这样，其表达将受到内源调控元件的控制，维持在生理水平，从而极大降低毒性风险。

大海捞针：从418个候选者中筛选最佳底盘

为了找到最适合改造的“天选之子”，研究人员设计了一套高通量筛选系统。他们利用慢病毒文库，针对所有 418个 高置信度的人类tRNA基因设计了对应的先导编辑向导RNA（epegRNA），试图将它们的反密码子分别突变为识别TAG、TGA或TAA终止密码子的序列。

筛选结果喜忧参半。喜的是，精氨酸（Arg）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）和丝氨酸（Ser）的tRNA骨架确实展现出了潜力。忧的是，效率太低。

虽然在内源位点实现了约 29% 的等位基因转化率，但在单拷贝报告基因模型中，仅靠改变反密码子的tRNA（ac-only sup-tRNA）并未引发显著的PTC通读。即使是过表达报告基因，相对于野生型对照，蛋白产量的恢复也仅有 10% 左右。这揭示了一个残酷的现实：在生理表达水平下，仅仅改变反密码子是不够的，必须对tRNA进行深度的工程化改造。

深度进化：打造“超级”抑制性tRNA

为了解决活力不足的问题，研究人员对tRNA进行了全方位的优化。首先是前导序列与终止序列的博弈。研究人员测试了 11,543种 “前导序列+tRNA变体+终止序列”的组合。结果发现，直接紧邻tRNA成熟序列的5个胸腺嘧啶（5T）构成的合成终止序列，其性能优于大多数内源终止序列。这可能是因为高效的转录终止促进了RNA聚合酶III的再循环。

接下来的工作如同在分子上进行微雕。研究人员推测改变反密码子可能破坏了tRNA的结构稳定性，于是对候选tRNA进行了饱和突变筛选。

通过分析海量数据，他们发现了一系列惊人的“增效突变”，尤其是位于反密码子茎部的突变（如第38位的A>T等）。有趣的是，这些突变效果是可以叠加的。当将最有益的突变组合引入到tRNA-Leu-TAA-1-1中时，奇迹发生了：与仅改变反密码子的版本相比，工程化改造后的sup-tRNA产生的全长GFP蛋白产量提高了 5倍，达到了野生型对照细胞的 35%。

这已经远远超过了许多隐性遗传病所需的治疗阈值，且这是在单基因组拷贝、内源启动子驱动的前提下实现的。

先导编辑的极致优化：精准安装“补丁”

有了完美的序列，下一步是精准写入。研究人员设计了包含 17,280种 工程化pegRNA（epegRNA）的文库，系统性优化了引物结合位点（PBS）和逆转录模板（RTT）的长度。

为了应对DNA错配修复（MMR）通路的干扰，研究人员采用了共转染显性负性MMR蛋白（MLH1dn）的策略，或引入沉默突变以逃避监测。最终，在一系列优化后，他们在HEK293T细胞中实现了对内源tRNA位点高达 60%-80% 的编辑效率。这意味着，培养皿中绝大多数细胞的那个冗余亮氨酸tRNA，已被成功置换成了定制的“超级”sup-tRNA。

安全性的灵魂拷问：是否误读天然终止子？

如果它能通读致病的TAG，为什么不会通读基因组里正常的TAG？这是所有sup-tRNA疗法面临的最大质疑。本研究提供了令人信服的数据。

首先是转录组层面的沉默。RNA测序显示，细胞在编辑后没有表现出明显的应激反应。其次是蛋白质组层面的“双重保险”。研究人员在全蛋白组水平上未发现任何内源蛋白质丰度发生显著变化。

为了挑战极限，他们挑选了69个表达量最高的、以TAG结尾的内源蛋白质，利用高灵敏度的靶向离子质谱寻找“通读肽段”。结果令人震惊：在预测的111个潜在通读肽段中，仅检测到了 1个，且其丰度与未处理组相比无统计学差异（adjusted P > 0.05）。

这一极高的安全性窗口可能归功于天然终止密码子（NTC）独特的序列环境：其一，多重终止信号。 NTC下游往往紧跟其他终止密码子。其二，终止环境。 NTC周围的3' UTR序列有助于招募释放因子，其竞争力强于sup-tRNA。其三，mRNA稳定性。 即使发生偶然通读，产物也往往被质量控制机制迅速降解。

广谱救赎：从细胞模型到Hurler综合征小鼠

为了验证广谱性，研究人员构建了包含 14,746个 致病性TAG突变的庞大文库。结果显示，仅靠单一的ac-only sup-tRNA，就能在超过 70% 的序列背景下实现有效通读。在涵盖巴替氏病、泰-萨克斯病等多种遗传病的细胞模型中，PERT策略成功恢复了 17%-70% 的酶活性。

终极考验来自于Hurler综合征（粘多糖贮积症I型）小鼠模型。这是一种严重的溶酶体贮积病。研究人员通过脑室注射AAV9病毒载体处理新生小鼠，7周后在心脏、大脑皮层和肝脏中观察到了 6%-8% 的编辑效率。

对于酶缺陷病，这已足够逆转乾坤。生化分析显示，治疗组小鼠心脏、大脑皮层和肝脏中的IDUA酶活性分别恢复到了野生型水平的 7.6%、6.3%和1.7%。组织病理学评分证实，治疗组小鼠大脑浦肯野细胞、肝脏和脾脏中的空泡几乎完全消失，器官状态与健康小鼠已无显著差异。

基因编辑的下半场是“通用化”

这项研究标志着基因编辑疗法正从“定制化”走向“通用化”。PERT策略的核心魅力在于其 “一种药物，治疗百病”（one composition of matter to treat diverse genetic diseases）的潜力。这意味着我们可以集中资源优化这一种试剂，一旦成功，即可惠及数千种罕见病，打破孤儿药研发的成本魔咒。

当然，PERT并非完美无缺。目前的优化主要集中在TAG和TGA终止密码子，最顽固的TAA密码子仍是挑战。此外，递送效率和氨基酸置换的兼容性也需进一步探索。但David Liu团队的工作，通过精密的进化筛选和先导编辑技术，确实将细胞内一个默默无闻的tRNA变成了拯救生命的“万能钥匙”。对于那些受困于罕见基因突变的患者来说，该研究或许就是他们等待已久的希望蓝图。