获得诺奖后，mRNA技术的下一程：广阔前景与未来趋势

mRNA新冠疫苗的巨大成功重新唤起了人们对于使用mRNA表达治疗性蛋白质的兴趣。除了mRNA新冠疫苗以外，使用mRNA表达血管内皮生长因子（VEGF）来治疗心力衰竭，以及基于CRISPR-Cas9 mRNA 治疗罕见遗传病的mRNA已经开始了一系列临床试验。

然而，在mRNA被确立为一种治疗罕见和常见疾病的通用治疗方式之前，仍有一系列挑战有待解决。为了克服这些挑战，科学家们正在开发一系列新技术，包括优化mRNA序列、开发具有器官/组织特异性的脂质载体，以及体内经皮给药系统。这些进展的结合，有望解锁mRNA疗法的前景，将mRNA疗法超越疫苗，用于治疗多种疾病类型。

2022年11月，Nature Biotechnology 期刊发表了一篇题为：Unlocking the promise of mRNA therapeutics 的综述论文，从mRNA的设计和纯化、提高mRNA表达时间和水平、改进mRNA的递送系统、组织特异性递送系统、重复给药策略等方面讨论了如何解锁mRNA疗法的前景，并总结了当前mRNA疗法的临床趋势。

mRNA新冠疫苗在全世界已经接种了数十亿人次，其安全性和有效性得到了广泛验证，也提示了我们开发疫苗以外的新一代mRNA疗法的潜力。

mRNA疫苗与mRNA疗法的不同之处

与mRNA疫苗相比，mRNA疗法的开发面临着更多挑战。因为mRNA疫苗只需要产生少量蛋白质，人体免疫系统会通过细胞和抗体介导的免疫反应放大免疫信号。而mRNA疗法需要mRNA疫苗所表达的1000倍以上的蛋白质水平才能达到治疗阈值。

而且，通常情况下，mRNA疗法需要作用于特定的靶通路、细胞、组织或器官。因此需要重视靶细胞对mRNA的吸收，这决定了mRNA表达的持续时间和水平。脂质载体递送到组织中的生物利用度、循环半衰期和递送效率，都时限速因素。

通过静脉注射，可以很容易让mRNA疗法靶向肝脏，但将其有效递送到其他实体器官仍然具有挑战性。此外，重复给药目前也面临障碍，对于慢性疾病的治疗而言，通常需要多次给药，但即使优化过的mRNA和LNP在多次给药后也会激活先天免疫，从而降低治疗性单白的表达。

mRNA疫苗与mRNA疗法

提高蛋白质产量

mRNA固有的免疫原性虽然增强了其作为疫苗的效力，但这也阻碍了其作为疗法的潜力。mRNA疗法需要高水平的蛋白表达以达到治疗效果，在用于酶替代疗法、局部再生疗法和肿瘤免疫疗法的小鼠模型中，通常需要比mRNA疫苗高50-1000倍的使用剂量。对于高蛋白表达水平的需求导致了多种优化mRNA的策略，以最小化免疫反应，增强mRNA稳定性和最大化翻译效率。

mRNA不同结构的优化

对UTR的优化有利于mRNA的翻译和稳定性。来自高表达基因的UTR序列，例如人α-珠蛋白基因或人β-珠蛋白基因的UTR被广泛用于mRNA合成，因为含有这些UTR的mRNA通常具有高水平的翻译和稳定性。通过高通量筛选或深度学习来识别新的UTR序列，可以提高mRNA的表达，合理组合5' UTR和3' UTR可以使翻译效率最大化。此外，长度为100-150个核苷酸的Poly(A)尾巴可以提高mRNA的稳定性，并通过与Poly(A)结合蛋白形成复合物来有效地启动翻译。

对于mRNA疫苗和mRNA疗法来说，最关键的进展或许就是发现对核苷的化学修饰可以显著降低mRNA的免疫原性、增加蛋白质表达水平。这也是迄今为止mRNA领域专利索赔的核心。除了对mRNA进行化学修饰以外，对mRNA序列进行密码子优化，也有望开发出有效的、无需化学修饰的治疗性mRNA。

自扩增mRNA（saRNA）利用RNA甲病毒的自我复制能力，可以在细胞内进行自我复制，从而减少给药量和频率，与线性且修饰的mRNA相比，在蛋白质表达水平相似的情况下，自复制mRNA用量只需前者的十分之一。目前已有多款自扩增mRNA新冠疫苗正在临床试验中。此外，自扩增mRNA还有另一种形式——反式扩增mRNA（taRNA），将复制酶和目标基因放在两个mRNA上，更安全，而且有助于减少mRNA的大小。

环状mRNA（circRNA），将线性mRNA进行环化，能够防止mRNA被外切酶降解，延长mRNA在细胞内的半衰期，从而增加其蛋白质表达总量。而且环状mRNA避免了线性mRNA必须添加的昂贵的5'端帽子和繁琐的Poly(A)尾巴。此外，环状mRNA无需进行化学修饰就能显著降低免疫反应。

需要注意的是，对mRNA的纯化，减少副产物双链RNA（dsRNA），不仅能够减低免疫反应，还能提高蛋白质表达水平。

递送载体系统

mRNA固有的不稳定性，导致了需要一个包装/递送系统来保护mRNA不被核酸酶降解，并允许其被细胞吸收、在细胞内释放、翻译成蛋白质。

细胞递送系统

LNP的一种替代方法是使用生物递送载体，例如细胞。这种方法是利用细胞旁分泌功能，直接在体外将mRNA合成的蛋白质引入细胞，而不是将mRNA递送到目标细胞。与人工合成的LNP相比，细胞载体具有许多优点，包括更高的生物相容性、更长的循环寿命，以及具有内源性细胞内/细胞间信号转导。

细胞被用作药物载体，将酶、治疗药物或脂质颗粒递送到目标部位。通过将mRNA引入各种可用的细胞类型（例如，免疫细胞、红细胞和间充质细胞）和进一步的基因工程，可以进行广泛的定制。这种方法也可以与现有的细胞疗法结合，以增强治疗效果。然而，基于细胞的mRNA疗法的递送可能受到细胞疗法通常存在的限制，如组织相容性问题、生产问题、繁琐的质量控制，以及细胞内递送能力等等。

细胞外囊泡在全身的细胞间通讯起着至关重要的作用，它们可以携带和运送各种各样的货物，从代谢物、短核酸和氨基酸，到长mRNA和蛋白质。作为天然囊泡，它们在给药方面具有多种优势，如生物相容性和低免疫原性。目前，细胞外囊泡，尤其是外泌体在肿瘤和心血管疾病的诊断、预后和治疗方面得到了广泛研究。

与以细胞为基础的递送系统类似，细胞外囊泡的细胞来源对其潜在应用至关重要。细胞外囊泡可以从其来源细胞那里“继承”特性，来自血细胞的细胞外囊泡在全身给药后保持其穿透血脑屏障（BBB）的能力，来自间充质干细胞的细胞外囊泡具有类似的抗炎和旁分泌特性。此外，临床前研究表明，来自各种细胞类型的细胞外囊泡不会诱导毒性，并在重复给药后具有良好的耐受性。因此，细胞外囊泡可作为一种可重复给药的递送载体，但其在应用中还面临着分离和高效装载的挑战。

LNP、细胞外囊泡、细胞和仿生载体的优势及面临的挑战

组织特异性靶向

要实现mRNA疗法的全部潜力，就需要更先进的体内递送系统，特别是对于心脏、肾脏、大脑和肺等实体器官的特异性递送。目前，肝脏是大多数分子疗法的首选器官，其丰度的血管系统有利于有效的均匀递送和大颗粒的通过。因此，简单的静脉注射就可以将mRNA高效递送到肝脏细胞并表达出治疗性蛋白质。然而，针对肝脏以外的器官，目前还需要改进递送系统以提高递送效率。

注射、吸入和鼻内给药

肾脏与肝脏不同，它会过滤掉大分子，只允许小分子通过。肾小球主动清除50 kDa以上的蛋白质，肾小球足细胞形成直径不足10纳米的滤过裂隙，阻碍了大多数从血液循环到肾脏的分子疗法。因此，需要直接通过导管向肾脏髓质或皮质注射来进行递送。有研究显示，可以通过这种方式对肾脏进行基因治疗或寡核苷酸治疗。

目前还没有针对肾脏的mRNA疗法进入临床，但有两项治疗肾脏疾病的miRNA疗法正在临床试验中。一种是靶向miR21的寡核苷酸抑制剂，用于治疗Alport综合征（一种遗传性肾病），目前处于2期临床试验阶段。另一种是靶向miR17的寡核苷酸抑制剂，用于治疗常染色体显性多囊肾病，目前处于1期临床试验阶段。

对于肺部而言，可通过吸入立即到达，允许使用较低的药物剂量，从而减少全身递送带来的副作用。吸入递送可以直接、快速、无创地进入肺泡和肺实质，而且肺部的核酸酶活性低于血清。但吸入给药也面临着特殊的挑战，mRNA必须高度浓缩，以承受气雾化过程中的剪切力。肺上皮表面的大表面积（约100平方米）和保护性粘膜的存在也是高效递送mRNA的天然屏障。因此，要想实现靶向肺部的mRNA疗法，就必须保持mRNA的完整性，使其穿过黏膜、进入细胞，释放mRNA并表达蛋白质。

一项通过吸入编码囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）的mRNA疗法在治疗囊性纤维化的1/2期临床试验中显示了很好的安全性，但肺部功能并未得到明显改善。

大脑是人体最复杂的器官，也是最难治疗的器官。它被头骨和脑膜保护着，而且还存在着特殊的血脑屏障（BBB）系统，血脑屏障的存在严重限制了药物向中枢神经系统（CNS）的递送。目前主要的努力方向是改变血脑屏障或绕过血脑屏障，通过直接注射到脑实质或脑脊液来提供治疗。但注射到脑脊液很难均匀靶向大脑，而直接注射到脑实质限制了药物在注射部位附近的递送。而且这些都是高风险的侵入式手术，需要很高的技术水平，限制了在换这种的广泛应用。

连接鼻黏膜和大脑的神经通路为非侵入性药物递送到中枢神经系统提供了潜在的途径，鼻子到大脑的神经通路能够在几分钟内将治疗药物快速递送到中枢神经系统，低分子量（<1kDa）和高亲脂性的药物有利于鼻内快速进入中枢神经系统。对于大分子药物，可以通过渗透促进剂来提高其生物利用度，针对大鼠的临床前研究显示，VEGF（分子量38.2 kDa）可在30分钟内通过鼻内给药直接递送到中枢神经系统，针对小鼠的临床前研究显示，鼻内给药阳离子脂质体包裹的mRNA可有效递送到特定的大脑区域。

将治疗性药物递送到大脑尤其具有挑战性，因为递送到达靶点并不能保证成功，大脑内皮细胞的P-糖蛋白还可能将递送进来的药物迅速排出。因此还需要增强特异性已到达特定大脑细胞类型。

在临床上，FDA已经批准了治疗脊髓性肌萎缩症（SMA）的Spinraza疗法，这是一款反义寡核苷酸（ASO）疗法，通过脑脊液直接注射治疗，这也是FDA批准的第一款治疗脊髓性肌萎缩症（SMA）的药物。但备受期待的治疗渐冻症（ALS）的ASO疗法Tofersen的3期临床试验失败了。

导管递送系统

自1929年 Werner Fossmann 首次成功应用心脏导管术以来，基于心脏导管的治疗已经成为现代心脏病学的一个组成部分，使冠状动脉疾病、瓣膜疾病和结构畸形的有效治疗成为可能。

在基因治疗和细胞治疗背景下，以心脏导管为基础的递送系统得到了广泛探索。由于心脏是心血管系统的中心器官，有多种途径可通过血管内接近心脏：通过心室导管经心内膜注射，通过冠状静脉导管经心外膜注射，以及冠状动脉内灌注和逆行性冠状静脉灌注。在过去的十年里，这些技术有了很大的进步，经血管壁微导管可以将细胞和其他治疗药物直接注入心脏组织中，提高疗效并降低不良事件的风险。这种血管内装置的临床前研究表明，它可以直接进入靶组织，包括心脏、肾脏和胰腺，而不需要封闭穿刺部位。

此外，还可以通过减少导管直径、优化输液参数、添加回流抑制功能来阻止沿导管的回流，来实现更小的侵入性。未来导管还会随着微电子元件的发展集成更多功能，例如通过磁性传感器和微型相机添加导航和定位功能。这些设备能够适应mRNA疗法的需求，未来也可以与靶向特定细胞的递送系统相结合。

工程化递送系统

迄今为止，针对RNA的封装和递送系统的设计通常聚焦在高递送效率、低免疫原性和细胞毒性，很少关注细胞特异性。因此，研究不同包装系统的体内生物分布至关重要。早期脂质纳米颗粒（LNP）通过ApoE与胆固醇分子的结合被肝脏积极代谢，促进其被肝细胞吸收，类似于低密度脂蛋白（LDL）的肝脏代谢。添加聚乙二醇化脂质可以减少LNP与ApoE的亲和性，从而减少LNP在肝脏的积累。

改变LNP的组分可以实现器官选择性靶向，例如2020年4月，德州大学西南医学中心 Daniel Siegwart 教授、程强（现为北京大学未来技术学院研究员）、魏妥（现为中科院动物所研究员）等在 Nature Nanobitechnology 期刊发表论文，开发了一种新型选择性器官靶向纳米颗粒平台——SORT。SORT递送系统通过在广泛使用的四组分LNP系统添加阳离子脂质、阴离子脂质或可电离脂质的第五种组分（SORT），可使mRNA选择性递送到小鼠的肺、脾或肝脏。详情：破解器官选择性mRNA递送系统的机制

SORT系统

此外，通过体内高通量筛选，也发现了具有组织和细胞特异性的新型LNP候选者，还可以通过外部刺激（光、热、磁或超声波）引导LNP与细胞的亲和性。将LNP与特异性抗体结合，也可以实现更高的细胞特异性靶向。

长期重复给药

在mRNA从疫苗向治疗药物过渡的过程中，能够在保持高蛋白质产量的同时，特异性和高效地重复递送能力是一个至关重要的要求。

蛋白质替代疗法就是一个生动的例子，例如在血友病的治疗中，血友病患者由于基因突变缺少凝血蛋白，由于蛋白质半衰期短，通常只有12小时，因此患者需要每周注射3-7次凝血蛋白。而针对小鼠的临床前研究显示，每周注射一次0.2-0.5mg/kg剂量的修饰的线性mRNA就能保持有效的凝血蛋白水平。使用腺相关病毒（AAV）的血友病临床试验显示，在注射后2年内，蛋白质表达稳定。但一些最近的研究显示，由于免疫系统对病毒载体的排斥，在注射5-7年后可能需要再次注射，而病毒载体有其自身的安全性问题，特别是在儿科疾病治疗中。

与蛋白质药物相比，mRNA疗法的真正价值是能够在细胞内合成高水平的治疗性蛋白质。mRNA疗法可用于治疗Crigler-Najjar综合征、甲基丙二酸血症、丙酸血症和囊性纤维化等在技术上难以使用蛋白质药物的代谢类疾病。例如，目前针对丙酸血症的治疗是每天使用Carglumic Acid治疗，虽然它缓解了体内氨的毒性积累，但并不能治疗代谢缺陷。相比之下，每三周两次给药的mRNA疗法显著改善了丙酸血症小鼠模型的症状，目前已处于1期临床试验阶段。

长期给药的主要问题是如何在多年的每次给药过程中保持蛋白质的稳定生产。大多数慢性蛋白质疗法会随着针对蛋白质或递送载体的抗体的逐渐增加而失去疗效。在对LNP递送的mRNA的小鼠研究中，经过3-6个月的长期慢性治疗，带把子表达水平几乎没有下降。但是一些研究显示，在重复给药后能够检测到抗药物抗体，这提示了我们需要仔细选择治疗方案。

早期临床研究主要关注LNP-mRNA的免疫反应和细胞毒性反应，体内研究显示，LNP组分中的可电离脂质会引起炎症，其中的聚乙二醇化脂质也具有免疫原性，由于我们在生活中经常接触聚乙二醇产品（例如药物、牙膏和护肤品），因此大多数人对聚乙二醇的敏感性不断增加。

在mRNA新冠疫苗接种中，小剂量的LNP-mRNA的局部递送已经可以观察到炎症并发症，而mRNA疗法需要高剂量的长期慢性给药将放大炎症并发症。此外，一些临床前研究显示，在蛋白质替代疗法中，长期使用LNP-mRNA会带来肝毒性。因此，需要在临床前动物模型中精心设计研究方案并详细监测以解决这些问题。

mRNA疗法的临床研究

mRNA新冠疫苗已经成功地完成了3期临床试验，并获得了FDA的批准，得到了广泛应用。而大多数mRNA疗法仍处于早期的临床1期研究解决，主要关注安全性问题。

mRNA疗法可以在全身系统或局部产生几乎任何蛋白质，因此具有广泛的治疗潜力，可通过mRNA表达的蛋白质类型包括酶蛋白、受体、细胞内蛋白、线粒体膜蛋白、分泌蛋白和基因编辑蛋白。

迄今为止，已有三项mRNA疗法临床研究在安全性和有效性方面都取得了令人鼓舞的结果，分别是治疗心力衰竭的VEGF-mRNA疗法，以及治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变性（ATTR）和遗传性血管水肿（HAE）的CRISPR/Cas9-mRNA疗法。

VEGF-mRNA治疗心力衰竭

基于血管内皮生长因子（VEGF）的治疗性血管生成已经被实验和临床研究了几十年。VEGF蛋白的半衰期太短，不到30分钟，这限制了其直接作为蛋白质疗法的价值。而使用基因疗法长期表达VEGF蛋白会带来血管通透性过高的毒性作用。和许多旁分泌因子一样，VEGF不是系统作用的，而是在局部以脉冲方式分泌，以剂量依赖性的方式到达靶细胞，然后迅速降解。

瑞典卡罗林斯卡学院的 Kenneth Chien 团队进过长达10年的努力，在小鼠模型、大型动物和首次人类临床研究中使用化学修饰的mRNA，证明了VEGF-mRNA可在数天内的稳定、短暂表达VEGF蛋白，这种短暂性表达自然限制了VEGF长期表达可能带来的毒性作用。在心脏手术患者中进行的2a期临床试验显示，直接向心脏注射VEGF-mRNA安全性良好，而且改善了患者的心脏功能，这表明mRNA疗法在器官修复特别是心脏再生中具有很大潜力。

mRNA编码的CRISPR基因编辑疗法

2021年6月26日，Intellia Therapeutics 在国际顶尖医学期刊《新英格兰医学杂志》（NEJM）发表了首个体内CRISPR基因编辑疗法的临床试验结果，这项名为NTLA-2001的CRISPR-mRNA疗法，通过LNP将携带靶向致病基因TTR基因的sgRNA和优化的spCas9蛋白的mRNA序列递送至肝脏，用于治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变性（ATTR）。详情：首个体内CRISPR基因编辑临床试验结果公布

这项临床研究大大扩展了CRISPR基因编辑疗法的应用范围，直接注射CRISPR-mRNA即可在体内进行高效基因编辑，为许多遗传疾病的治疗开辟了新的途径。2022年6月24日，Intellia公布了NTLA-2001疗法的最新1期临床试验中期数据，效果积极，单次给药后患者血清中TTR蛋白水平的下降幅度在长达12个月时间里能够稳定持续。

2022年11月12日，Intellia宣布其第二款体内CRISPR-mRNA基因编辑疗法——NTLA-2002，在治疗遗传性血管水肿（HAE）的1/2期临床试验的中期数据积极。10名接受不同剂量治疗的遗传性血管水肿（HAE）成年患者中，所有不同剂量（25mg、50mg、75mg）治疗的患者的致病性的激肽释放酶均显著下降，分别在第32周、第22天、第16周时下降64%、81%、92%。患者在接受单次治疗后疾病发作频率显著下降。详情：一次注射长期有效，第二款体内CRISPR疗法临床数据发布

随着时间的推移，对递送载体的改进，可能会让CRISPR-mRNA疗法超越肝脏，应用于心脏、肾脏，以及中枢神经系统等其他实体器官的治疗。

mRNA疗法的范围

尽管mRNA疗法在大型动物以及临床试验中的长期安全性和有效性仍在研究中，但我们已经可以动物研究和已进行的少量后期临床研究中看出mRNA疗法在近期临床发展的轮廓。

mRNA具有一系列固有优势，可以快速生成切割或多个候选mRNA，使其以独立于细胞的形式存在，还易于创建mRNA组合。尽管目前基于LNP递送mRNA进行全身长期给药还存在调整，但一次性给药似乎已经很简单了。

在组织特异性靶向方面，临床研究表明，静脉注射LNP-mRNA能够在肝脏中高表达蛋白质，而直接新肌内注射的裸mRNA可在整个心脏中被摄取和表达。因此，将mRNA直接注射到各种实体器官的新兴递送系统可能会开辟新的靶点和临床适应症。对于需要严格控制蛋白质表达水平和持续时间的疾病，mRNA提供了一种剂量依赖性，能够限制蛋白质长期过表达或脱靶的CRISPR基因编辑的毒副作用，这是基于DNA的基因治疗载体不容易实现的。

mRNA疗法在慢性疾病治疗中的应用，需要解决的一个长期目标是免疫原性问题。临床前研究显示，与重组蛋白疗法相比，mRNA疗法具有更高的蛋白表达谱，而重组蛋白疗法具有较少给药的优势。在短期内，鉴于mRNA在细胞内快速表达蛋白质的能力，mRNA疗法可用于紧急治疗，以帮助患有急性衰弱和危及生命的疾病的患者，如甲基丙二酸血症。

最近30年来科学和临床的进步，以及在mRNA新冠疫苗开发中的努力，预示着mRNA疗法的美好未来。如今，我们已经能够在自动化、可扩展、无细胞的模式下，只通过点击几下鼠标就能快速完成临床级别的mRNA的设计和合成。

在不久的将来，我们还有可能生成模块化、可扩展的GMP级制造单元，可以设置在任何GMP级设施中，从而消除对冷链运输的需求。以冻干形式储存的mRNA疗法也将出现，这将在很大程度上解决目前mRNA疫苗因运输和保存难度带来的分配问题。随着新的LNP和非LNP载体的开发，其副作用也将得到改善。载体容量的增加，让递送复杂基因和碱基编辑变得可行，再加上可重复给药，mRNA疗法有望取代当前的蛋白替代疗法。

回顾重组蛋白疗法的历史，在这一领域的早期，人们预计大多数生长因子将成为药物。然而，在VEGF被克隆30年后的今天，它是否会成为临床有价值的治疗手段仍然有待观察。因此，mRNA疗法的未来可能取决于将这种“生命的软件”与人类生理系统的“硬件”相匹配，提高精度，在安全性条件延长持续时间，进行长期慢性给药。

在未来的几年里，mRNA、细胞内载体和体内递送系统的快速发展，加上深入的生物学和临床洞察力和直觉，应该会为许多无法通过其他治疗方式轻易满足的临床需求的患者带来新的希望。