Nature：从二维到三维！RNA分子动态结构的全新解析之路

RNA的“动态舞者”：为什么RNA结构如此复杂？

RNA（核糖核酸）不仅是遗传信息的传递者，更是生命活动的“动态舞者”。作为分子中的多面手，RNA能够在细胞环境中以多种构象存在，而这一特性正是其功能实现的基础。然而，与蛋白质不同，RNA的动态性和异质性使其成为研究人员解读的难题。

RNA的结构复杂性源自其独特的化学和物理属性。研究表明，许多功能性RNA分子，如核酶（ribozymes）和核小体，能够在不同的环境下采取多种三维构象，这些构象并非随机变化，而是受控于序列中的特定结构域。例如，一个包含210个核苷酸（nt）的RNA分子即使保持良好的二级结构，也能在生理条件下表现出高度的构象异质性。这种现象已在研究中得到了实验验证，结果表明RNA的构象异质性不同于未折叠蛋白质的无序状态，而是功能性RNA的一种特性。

RNA的动态特性赋予了其多重功能。例如，RNase P RNA在催化前tRNA的成熟过程中需要多种构象，以适应不同底物和细胞环境。这种异质性还使RNA能够与不同的配体特异性结合，为其参与调控、催化和信息传递提供了分子基础。

RNA的动态性不仅让研究人员对其“舞蹈”的复杂节奏感到敬畏，也昭示着这一分子在生物学和医学领域的巨大潜力。

研究人员的困境：传统方法的局限性

研究人员在揭示RNA分子复杂结构的道路上面临着诸多技术挑战。尽管核磁共振（NMR）、X射线晶体学和冷冻电镜（cryo-EM）在解析蛋白质和稳定RNA分子的结构方面取得了巨大成功，但这些传统方法在应对RNA的动态特性和异质性时，常常显得捉襟见肘。

RNA分子的动态性和柔性是理解其功能的关键。研究表明，许多功能性RNA并非以单一稳定的三维结构存在，而是动态地游走于多个构象之间。然而，传统方法要求样品的高度均一性，这与RNA的多态性天然矛盾。例如，NMR虽然能够提供高分辨率的原子级信息，但仅适用于小分子RNA或稳定的二级结构，面对大分子RNA的动态性时，信号重叠和复杂性令解析工作变得异常艰难。

X射线晶体学以其清晰的三维分子图谱著称，但RNA分子的柔性和异质性使其在晶体环境中难以形成稳定的周期性排列。即使成功结晶，获得的静态快照也难以反映RNA在生理条件下的真实动态。

冷冻电镜（cryo-EM）作为一种突破性技术，可以捕捉到大分子复合物的形态，但其依赖信号平均的特性无法有效解析RNA分子的异质性。特别是当RNA以多种构象共存时，冷冻电镜的分辨能力往往被限制在分子轮廓级别，而非原子精度。

更重要的是，RNA结构的复杂性远远超越了这些传统技术的设计初衷。许多RNA序列的三维结构在目前的数据库中没有对应，因此像AlphaFold这样的基于蛋白质结构预测的工具对RNA无能为力。RNA结构研究领域因缺乏大规模的结构数据库和序列-结构关联，而长期被困于技术瓶颈中。

这些传统方法的局限性催生了研究人员对新方法的渴望，而HORNET的出现正是为破解这一困境带来了新的曙光。

解锁RNA奥秘的新钥匙：HORNET方法的诞生

为了破解RNA结构研究中的难题，研究人员开发了一种名为HORNET（Holistic RNA Structure Determination）的全新方法。该方法结合了原子力显微镜（AFM）的高分辨率成像技术与深度神经网络（DNN）的强大学习能力，首次实现了RNA分子在溶液环境下多种构象的直接解析。这项技术不仅填补了现有技术的空白，还为RNA结构生物学开辟了一个全新的研究方向。

HORNET的核心理念是通过AFM捕捉RNA分子的高精度表面拓扑图像，然后借助深度神经网络从中解析出三维结构。AFM以其高信噪比著称，能够在生理条件下直接观察单个RNA分子的构象变化。相比于传统依赖信号平均的方法，AFM的高灵敏度使其能够分辨RNA分子的异质性，并清晰呈现其主要的二级和三级结构特征。例如，研究人员利用AFM捕捉到长度超过200个核苷酸的RNA分子不同构象的细节，分辨率可达11至12埃（Å），足以显示双螺旋的沟槽结构。

然而，单纯的AFM图像并不能直接揭示RNA的原子级三维结构。为此，HORNET整合了深度神经网络，通过训练超过350万种RNA模型的数据库，使其能够从AFM的二维图像中提取峰值能量、拓扑特征以及构象间的动态关联。深度神经网络不仅能识别RNA分子的整体构象，还能准确预测其与真实结构的偏差，其均方根偏差（r.m.s.d.）可低至3.5 Å。

这种方法的突破性在于其全面性与精确性：AFM提供了实验数据的物理约束，而深度学习则确保了对RNA分子异质性的细致解析。研究人员利用HORNET成功解析了多种功能性RNA，包括RNase P RNA和HIV-1 Rev响应元件RNA（RRE RNA），展现了RNA在不同生理状态下的动态特性。

基于HORNET的整体RNA结构解析流程（Credit: Nature）

HORNET的总体工作流程（a）

HORNET方法从实验获取的AFM拓扑数据（包括x、y和z三维信息）和初始模型开始，通过AFM数据和基于结构的伪势能函数驱动动态拟合过程。在这一过程中，生成了粗粒度模型，这些模型包含了能量值的完整列表以及与AFM拓扑的整体拟合程度（CCAFM）。这些信息随后被传递到无监督机器学习（UML）和/或深度神经网络（DNN）中，用于模型的聚类和精度估算，主要以均方根偏差（r.m.s.d.）作为衡量指标。如果DNN收敛，即模型群体的r.m.s.d.分布中有显著部分低于7 Å，则将最优的前10个模型转化为全原子坐标模型。如果未收敛，则基于不同的初始模型或延长动态拟合时间重新进行计算。

UML和DNN的主要步骤（b）

图示详细展示了UML和DNN的关键分析步骤，包括主成分分析（PCA）和基于能量和拓扑特征的聚类。DNN通过利用RNA伪数据库（psDatabase）的结构训练，进一步提高了模型精度的估算能力。

RNA伪数据库（psDatabase）（c）

展示了一个包含350万个连续轨迹模型的数据库，这些模型来自RNase P RNA（RPR）的催化域，用于训练和优化机器学习算法。经过训练的DNN架构能够基于AFM拓扑数据，准确估算RNA结构模型的精度。

HORNET的基准测试（d）

HORNET方法使用了大约5600万个动态拟合生成的轨迹模型，这些模型分为以下几个组别：训练-训练验证-测试组（BM0、BM1和BM2），用于训练和初步验证DNN模型的能力。验证-测试组（BM5），用于进一步验证算法性能。完全盲测组（BM3和BM4），用于测试DNN对未见数据的泛化能力。

从二维影像到三维结构：HORNET如何运作？

HORNET方法的神奇之处在于它能够将原子力显微镜（AFM）生成的二维拓扑影像，转化为精确的RNA三维结构模型。这一过程既依赖AFM的高信噪比数据，也得益于深度神经网络（DNN）的学习和预测能力，为RNA结构解析提供了全新视角。

HORNET的工作流程分为三个主要阶段。首先，AFM通过其顶级的成像技术捕捉RNA分子的表面形态。在生理条件下，AFM能够以纳米级分辨率直接观察单个RNA分子的构象特征。这些高质量的二维图像不仅展示了RNA的整体轮廓，还包含了关键的局部信息，例如双螺旋沟槽和结构域的排列。相比于传统信号平均技术，AFM的单分子成像避免了异质性信息的丢失。

接下来，HORNET利用动态拟合技术，将这些二维影像与初始的粗粒度RNA模型相匹配。这个过程中，研究人员引入伪势能函数（pseudo-potentials）和经典吉布斯自由能（Gibbs free energy）约束，逐步优化模型的拟合精度。在数百万次模型拟合的基础上，HORNET能够筛选出与实验影像最匹配的构象模型。

最后，深度神经网络登场。研究团队构建了一个包含超过350万个RNA模型的训练数据库，通过机器学习算法让网络掌握从二维影像中提取三维信息的能力。训练后的网络不仅能够精准评估每个模型的结构精度，还能从大量候选模型中识别出最佳的十个原子坐标模型。在研究中，HORNET通过无监督学习和有监督学习相结合的方法，将解析精度控制在均方根偏差（r.m.s.d.）低于3.5 Å。

这一整合了实验与计算技术的工作流程，让HORNET能够实现传统方法难以企及的效果。例如，HORNET在解析HIV-1 Rev响应元件RNA的过程中，不仅展示了RNA的多构象特性，还揭示了其与配体结合的关键位点及结构变化。这种将二维影像“还原”为三维结构的能力，让RNA的动态世界得以前所未有的清晰呈现。

应用实例：揭开RNase P RNA和HIV-1 RRE RNA的动态秘密

HORNET方法的实际应用充分展现了其在RNA研究中的强大功能。通过解析功能性RNA分子的异质性构象，HORNET成功揭开了RNase P RNA和HIV-1 Rev响应元件RNA（RRE RNA）在动态状态下的结构奥秘，为RNA功能与结构之间的关系提供了新的见解。

RNase P RNA是一种具有催化功能的核酶，参与前体tRNA的剪切成熟。在研究中，HORNET通过AFM捕捉到RNase P RNA的多个构象，并利用深度神经网络解析了其三维结构特征。这些构象不仅展示了RNA分子在不同状态下的结构差异，还揭示了其构象变化与底物结合及催化活性之间的密切关联。例如，研究发现RNase P RNA在不同构象下表现出显著的灵活性，这种灵活性可能是其适应多种底物的关键。此外，通过比较不同构象的模型，研究人员进一步确认了多个关键结构域在RNA功能中的重要作用。

另一项突破性应用是对HIV-1 RRE RNA的研究。RRE RNA是HIV病毒生命周期中的关键分子，负责与Rev蛋白结合并促进病毒RNA的核输出。然而，由于其异质性和动态性，RRE RNA的三维结构长期未能明确。HORNET通过AFM捕捉到五种不同的RRE RNA构象，并通过动态拟合和深度学习解析了其三维模型。这些模型显示，RRE RNA在不同构象下的两个Rev结合位点始终保持面对面的排列，且其间的距离在45至70 Å之间变化。这一发现不仅验证了RRE RNA的构象灵活性，还揭示了这种动态性可能是其特异性识别Rev蛋白的基础。

这些证据充分说明了HORNET方法在RNA结构解析中的独特优势。它能够在单分子层面揭示RNA的动态特性，为研究RNA的功能机制和药物靶点提供了重要工具。无论是RNase P RNA的底物适应性，还是RRE RNA与Rev蛋白的特异性相互作用，HORNET都以其强大的解析能力为RNA研究注入了新的活力。

HORNET的独特价值：改变RNA结构研究的游戏规则

RNA的结构解析一直是生命科学领域的难题，尤其是那些具有高度异质性和动态性的RNA分子。传统技术虽然提供了RNA结构研究的重要基础，但在应对异质性RNA分子时，其局限性显而易见。而HORNET方法的诞生，不仅为RNA结构解析提供了新工具，还从根本上改变了这一领域的研究规则。

HORNET的独特价值在于其整合了实验数据与计算模型的能力，使得RNA分子的动态特性得以精准还原。通过AFM的高分辨率成像技术，HORNET能够在生理条件下捕捉单个RNA分子的构象信息，而无需依赖传统技术的信号平均。这意味着，HORNET可以直接观察到RNA的异质性，为揭示RNA分子在不同环境下的真实动态提供了可能。

另一方面，HORNET结合了深度神经网络的学习能力，从而克服了现有RNA数据库的局限性。RNA分子的三维结构在数据库中的覆盖率极低，而HORNET通过训练超过350万个模型的伪数据库，构建了能够预测未知RNA结构的高效算法。这种结合实验和计算的方式，不仅提高了结构预测的精度（均方根偏差低至3.5 Å），还为RNA研究提供了可扩展的分析框架。

此外，HORNET方法还展示了对大分子RNA和复杂构象的解析能力。传统方法往往受限于分子大小或结构复杂性，而HORNET通过动态拟合技术和全局拓扑约束，可以解析超过200核苷酸的RNA分子。这种能力使HORNET能够研究更多具有生物学功能的重要RNA分子，例如RNase P RNA和HIV-1 RRE RNA。

最重要的是，HORNET方法为RNA靶向药物开发提供了新途径。例如，在HIV-1 RRE RNA的研究中，HORNET揭示了关键结合位点的动态变化，为设计更高效的抗病毒分子奠定了基础。它的应用不仅扩展了我们对RNA生物学的理解，也为RNA在医学和生物技术中的广泛应用铺平了道路。

HORNET的未来潜力

首先，在RNA靶向药物开发中，HORNET技术的引入将改变传统的药物筛选模式。RNA作为药物靶点的吸引力日益增长，尤其是在治疗难以攻克的疾病（如癌症、病毒感染和神经退行性疾病）中。然而，RNA的异质性和动态性长期限制了靶点预测和药物设计的效率。HORNET通过捕捉RNA分子在生理条件下的真实构象，揭示了关键功能区域的动态变化。例如，研究人员利用HORNET解析HIV-1 RRE RNA的构象，确定了关键结合位点的相对位置和动态特性。这一发现为开发高效阻断HIV病毒复制的药物提供了直接指导。

其次，HORNET在合成生物学领域展现了巨大潜力。设计具有特定功能的RNA设备（如开关、传感器或催化剂）需要对RNA的结构与功能关系有深刻的理解。HORNET的动态结构解析能力，为合成RNA分子的优化提供了可靠支持，使得RNA设备的设计更加高效精准。例如，利用HORNET解析的RNA构象可以指导设计多功能核酸分子，以实现精准调控基因表达或靶向特定分子路径的能力。

此外，HORNET的应用还可延伸至新兴的RNA疗法，如mRNA疫苗和RNA干扰（RNAi）技术。通过深入了解RNA的动态特性，研究人员可以优化RNA药物的稳定性和特异性，从而提高疗效并减少副作用。在新冠病毒mRNA疫苗的快速开发背景下，HORNET技术有望为下一代RNA疫苗的设计提供革命性支持。

未来，随着HORNET技术的不断优化，其在其他领域的潜在应用也不容小觑，如RNA-蛋白相互作用的研究、RNA纳米技术的开发等。HORNET不仅是一种解析RNA分子的新工具，更是一座连接基础科学和实际应用的桥梁，为RNA研究和生物技术的创新开辟了广阔的前景。