Cell：谢一轩/柴培远等揭示修饰的RNA碱基acp3U是糖RNA中N-聚糖的结合位点
来源：生物探索 2024-09-08 13:47
该研究首次揭示了糖RNA在分子结构和生物学基础方面的信息，为糖RNA的存在提供了直接证据，并为后续RNA糖基化的生物合成以及生物功能研究奠定了基础。
糖基化 (Glycosylation) 是生物分子最普遍、最重要的修饰之一，这些修饰在细胞识别、信号传导、蛋白质折叠和稳定性以及免疫反应等生物过程中发挥关键作用【1】。已知的糖基化生物分子主要包括蛋白质和脂质。在一次偶然的实验中，斯坦福大学诺贝尔化学奖得主Carolyn Bertozzi的博士后Ryan Flynn发现，唾液酸的非天然分子SiaNAz (叠氮化唾液酸) 竟然可以通过细胞自身的代谢途径标记RNA分子。后续通过一系列的研究，题为Small RNAs are modified with N-glycans and displayed on the surface of living cells的论文于2021年在Cell上正式发表，这是科学家们首次意识到糖基化RNA存在的可能【2】。在此之后，关于RNA糖基化的标记、监测及生物功能的研究逐渐在各大期刊上发表。然而，很多科学家对糖RNA分子的存在存疑，其中一个至关重要的信息一直未被解析：RNA如何与N-聚糖连接在一起？这一信息对于验证糖RNA分子的真实存在以及后续研究糖RNA分子的合成途径和生物功能都不可或缺。然而，由于糖RNA分子含量极低（预计在总体RNA分子中的含量低于0.001%），依赖传统手段获取这一关键信息极其困难。
现为波士顿儿童医院助理教授的Ryan Flynn联合来自华盛顿圣路易斯大学医学院的生物质谱专家Benjamin Garcia课题组在Cell上发表了文章The modified RNA base acp3U is an attachment site for N-glycans in glycoRNA，首次证明了修饰的RNA碱基acp3U（3-(3-amino-3-carboxypropyl)uridine）是糖RNA中N-聚糖的结合位点，谢一轩博士（Garcia课题组）和柴培远博士（Flynn课题组）为论文共同第一作者【3】。
首先，为了更高效地标记糖RNA分子，研究团队开发了一种新型化学工具—rPAL。该技术在温和高碘酸氧化条件下 (7.5mM NaIO4, 10 分钟，室温)，与糖RNA上唾液酸中的邻二醇发生特异性反应。这一反应导致连接羟基的两个碳原子间的碳-碳键发生断裂形成醛基，再利用带有生物素的羟胺实现糖RNA分子的特异性标记。结果证明，rPAL技术不仅能够特异性标记糖RNA，而且与之前的SiaNAz方法相比，信号增益提高了150倍之多，大幅提升了对糖RNA的标记能力。
建立rPAL技术后，作者通过生物素-亲和素系统和强洗涤条件对糖RNA进行了富集，并对富集得到的糖RNA进行灵敏的RNA修饰质谱分析。结果显示，含有羧基的acp3U核苷在四种不同条件下均被广泛检测到。基于PNGase F酶释放反应通常会将会将N-糖与底物连接的酰胺转化为羧基，因此作者推测acp3U分子中的羧基很可能是由PNGase F酶解所产生。在含有氧16和氧18的水中分别对富集的糖RNA进行PNGase F释放后进行产物分析，结果显示acp3U在两个条件下分别产生了对应的氧16和氧18标记的质量 (346.12 m/z以及348.12 m/z)，并且其与acp3U标准样品在液相色谱中的保留时间及二级质谱信息完全吻合，这一结果证明了之前的猜想。进一步，研究团队通过糖苷内切酶Endo F2和 Endo F3对富集产物进行酶解，留下了单N-乙酰葡萄糖胺记号在RNA分子上，再通过靶向质谱鉴定出带有N-乙酰葡萄糖胺的acp3U化合物，为RNA与糖质相连提供了直接的证据。
模式图（Credit: Cell）
最后，研究团队在细胞中敲除了acp3U合成酶家族中的DWDT2，结果显示糖RNA信号显著降低，这一发现从生物学层面揭示了acp3U生物合成对糖RNA的影响，进一步证明了acp3U与糖RNA之间的联系。
总之，该研究首次揭示了糖RNA在分子结构和生物学基础方面的信息，为糖RNA的存在提供了直接证据，并为后续RNA糖基化的生物合成以及生物功能研究奠定了基础。值得一提的是，Ryan Flynn课题组近期再次联合Benjamin Garcia 课题组以及Daniel Bojar课题组在预印本bioRxiv发表了题为O-glycosylation contributes to mammalian glycoRNA biogenesis的文章，提供了RNA O-糖基化存在的证据【4】。这些发现不仅丰富了我们对RNA糖基化的理解，还为未来开发基于糖RNA的新型诊断和治疗策略提供了更多可能性。
参考文献：
[1] Varki et al., Essentials of Glycobiology (4th edition), 2022. DOI: 10.1101/9781621824213
[2] Flynn et al., Cell, 2021. DOI: 10.1016/j.cell.2021.04.023
[3] Xie et al., Cell, 2024. DOI: 10.1016/j.cell.2024.07.044
[4] Porat et al., bioRxiv, 2024. DOI: 10.1101/2024.08.28.610074
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