清华大学杨茂君团队连续发文破译线粒体超大分子量多酶复合物的全景空间结构及组装机制

丙酮酸脱氢酶复合体（Pyruvate Dehydrogenase Complex，PDHc）和α酮戊二酸脱氢酶复合体（2-Oxoglutarate Dehydrogenase Complex，OGDHc）是定位于线粒体基质的超大分子量多酶复合物。二者同属α-酮酸脱氢酶复合体家族（OADHc family），该家族成员主要由三个种类的酶单元多聚构成：（E1）α-酮酸脱氢酶家族蛋白；（E2）酰基转移酶家族蛋白；（E3）黄素蛋白；其分子量在4到10兆道尔顿（MDa）之间。

长期研究表明，OADHc在线粒体内多条能量代谢通路上均发挥重要作用。其中，PDHc作为糖代谢过程中的门控蛋白（gatekeeper），负责催化糖酵解终产物丙酮酸的氧化脱羧，生成三羧酸循环的初始底物乙酰辅酶A，承担着连接两大代谢途径的枢纽功能。OGDHc催化α酮戊二酸的氧化脱羧，生成NADH和琥珀酰辅酶A，是三羧酸循环中关键的限速酶。此外，OGDHc在其他细胞代谢活动中也扮演着重要角色，包括调控蛋白和Ca2+信号，控制多种蛋白的翻译后修饰，以及调控基因表达的功能。

临床研究证实，PDHc和OGDHc的催化活性对人体内血糖平衡的维持起到关键作用。这两种多酶复合物的功能缺陷将引起线粒体供能障碍，导致包括帕金森综合征、阿尔兹海默病在内的多种神经退行性疾病，以及高乳酸血症、Leigh氏综合征等一系列严重的代谢疾病2。

OADHc多年来一直是能量代谢领域内的研究热点之一。然而，由于该家族复合体的组成复杂、构象多变、且整体结构具有高度柔性，导致人们始终无法一窥其全貌。复合体的核心亚基构成比例和外周亚基分布规律等具体结构信息也始终存在争议。

因此，深入研究PDHc和OGDHc的结构与功能，对于理解OADHc家族蛋白的动态催化反应机理和相关疾病的发病机制具有重要意义。杨茂君课题组近十年来一直在努力开展这些能量代谢相关重要复合物结构、功能及药物开发研究。

近期，清华大学/北京生物结构前沿研究中心杨茂君课题组和李赛课题组合作，在 Protein & Cell 期刊上发表了题为：Molecular architecture of mammalian pyruvate dehydrogenase complex 的研究论文。

清华大学/北京生物结构前沿研究中心杨茂君课题组在 Nature Communications 期刊发表了题为：Molecular architecture of the mammalian 2-oxoglutarate dehydrogenase complex 的研究论文。

这两项研究工作首次揭示了哺乳动物PDHc和OGDHc的整体空间结构，并通过相关生化实验，提出了全新的PDHc及OGDHc分子组装机制。这一进展不仅为理解OADHc家族蛋白的功能提供了新的视角，还能为分子动力学模拟，靶向PDHc和OGDHc的药物研发，以及能量代谢疾病的治疗提供新的思路。

杨茂君课题组研究团队在蛋白纯化方面进行了大量的条件摸索与方法创新，优化了经典的线粒体多酶复合物分离技术，从猪心肌细胞中分别提取了高纯度、高活性、状态均一的内源性PDHc和OGDHc蛋白。利用冷冻电镜单颗粒分析技术（single-particle analysis），课题组解析了分辨率3.66 Å的PDHc正十二面体核心框架结构和分辨率3.3 Å的OGDHc正方体核心框架结构。但复合体外周亚基的空间排布呈现明显的非全同性，导致单颗粒分析难以对两种复合体的整体结构进行准确的三维重构。

清华大学生命学院李赛教授，长期从事高分辨冷冻电子断层成像技术（cryo-ET）开发及其在结构病毒学、原位结构生物学上的应用，在cryo-ET技术领域积累了丰富的经验。杨茂君课题组联合李赛课题组使用cryo-ET技术和子断层平均计算（subtomogram averaging）的方法，对PDHc的整体结构进行探究。同时使用同样的技术路线，杨茂君课题组对OGDHc开展了完整结构解析工作。在进行收集数据和处理后，研究人员获得了分辨率分别为11.7-Å、13.4-Å、10.2-Å的PDHc核心亚基E2p、外周亚基E1p和E3的密度；以及7.9 Å、9.7-Å、12.2-Å的 OGDHc核心亚基E2o、外周亚基E1o和E3密度图。通过对所有亚基的重投射，研究人员成功重构得到492个完整PDHc复合体结构和2,014个完整OGDHc结构。

统计分析结果显示，每个PDHc含有的E1p个数主要在17-24的区间，E3的个数则在8到16之间；而平均每个OGDHc中E1o和E3的拷贝数在4个左右，并且整体的E1o和E3的个数比接近1：1。但对每一个PDHc和OGDHc复合体来说，外周亚基的个数以及E1o与E3的比例变化同样较大。这一广泛的数量变化无疑对PDHc和OGDHc的结构异质性产生了重要影响。此外，研究人员研究还发现，PDHc的核心亚单位的占有率约为57%，这一水平与牛心PDHc的占有率（~50%）相当，但率高于牛肾（~38%）和其他已知微生物的占有率（嗜热毛壳菌，~44%），揭示了PDHc的核心占有率具有种属和组织特异性。OGDHc的核心亚基占有率则相对较低，大多都在25%-50%之间，这一结论同样可以从线粒体原位中的情况进行佐证。

通过对外周亚基相对核心框架的位置、距离和取向的统计分析，研究团队得以量化描述哺乳动物PDHc和OGDHc的空间排布规律。研究人员根据总结得到的整体结构信息，结合蛋白互作实验，对PDHc和OGDHc的外周亚基和核心亚基之间可能的结合模式进行了检测，提出了两种多酶复合物全新的分子组装模型。其中，PDHc含有6种不同的内外亚基结合方式，除经典的PSBD结合模式外（“E2p_PSBD-E1p”和“E3BP_PSBD-E3”），研究团队还发现了“E2p_PSBD-E3”和“E3BP_PSBD-E1p”的“错配”结合；OGDHc的组装模型一直没有清楚、全面的结论，研究人员发现，哺乳动物OGDHc具有E1o，E2o和E3三种亚基的六种不同结合状态，尤其是OGDHc在同家族蛋白中所独特的E1o和E3的结合模式。研究人员表示，多酶复合体复杂多样的组装模式也是导致其整体结构非全同的原因之一。同时，这种复杂且灵活的组装模式还能有效地增强其结构稳定性，以便于复合体在不同的代谢反应中发挥功能。

哺乳动物PDHc和OGDHc的分子组装模型

杨茂君教授研究组长期致力于线粒体蛋白结构研究、功能和相关靶向药物研发，这是继线粒体氧化磷酸化相关复合物之后，在线粒体能量代谢领域又一重大突破，为相关教科书的正确编写提供了详尽的分子基础。PDHc和OGDHc的整体结构阐述进一步加深我们对线粒体多酶复合物动态反应过程的理解，帮助我们对线粒体自身稳态调控的认识，同时也将为以线粒体为靶点的药物设计提供理论依据和技术指导。

清华大学/北京生物结构前沿研究中心杨茂君教授和李赛教授为 Protein & Cell 论文的共同通讯作者。清华大学生命学院博士后陈懋斐、博士后宋雨桐、张森森博士和2020级博士生张一堂为共同第一作者。杨茂君教授和清博汇能生物科技有限公司张森森博士为 Nature Communications 论文的共同通讯作者。清华大学生命学院2020级博士生张一堂、博士后陈懋斐、陈旭东博士、以及深圳大学博士后张铭晖为共同第一作者。