成功恢复生殖功能！广医三院安庚团队构建“无细胞”水凝胶支架，修复兔阴茎海绵体缺陷

近日，广州医科大学附属第三医院安庚教授团队在 Advanced healthcare materials 期刊发表了题为：Exosomes from Hypoxia Preconditioned Muscle-Derived Stem Cells Enhance Cell-Free Corpus Cavernosa Angiogenesis and Reproductive Function Recovery 的研究论文【1】。

该研究利用低氧预处理肌源性干细胞（MDSC）来源的外泌体来修饰3D打印的GelMA水凝胶支架，实现无细胞组织再生，成功修复兔阴茎海绵体缺损，恢复生殖功能并生育子代。

这项研究是继安庚教授团队2020年在 Nature Communications 期刊发表“全球首次”利用3D打印技术及干细胞成功修复海绵体缺损，使兔子恢复勃起和射精功能，并恢复生殖能力的研究成果后【2】，再次取得重要突破，为海绵体重建恢复男性生殖能力提供了重要的参考价值。这项研究为开发个性化的“无细胞”海绵体支架提供了新的思路，更好的推进临床转化。

聚焦问题，提出方案

临床中各种先天性男性外生殖器发育异常、阴茎肿瘤切除手术、会阴部外伤导致的阴茎缺损、血管性勃起功能障碍，阴茎硬结症等均需要进行阴茎海绵体重建手术，修复阴茎的生理结构和功能缺陷。受限于天然海绵体组织的严重缺乏和人同种异体阴茎移植的伦理争议，阴茎海绵体组织工程具有潜在的重要临床应用价值。

GelMA水凝胶作为生物支架在阴茎海绵体组织再生和功能修复方面展现了广阔的应用前景。微血管系统重建是组织工程修复阴茎海绵体缺损的关键步骤。常用于促进血管网络生成的主要方法，包括单纯注射各类促血管生长因子，如血管内皮生长因子等，或通过转染干细胞建立过表达谱系。研究团队以肌源性干细胞（MDSC）作为种子细胞，利用三点位突变方式构建了高表达稳态低氧诱导因子1α（HIF-1α）的MDSCs系。过表达HIF-1α的MDSC接种在3D打印的HAMA-GelMA生物支架显示了较好的促血管形成的效果。但是，基因转染的干细胞均存在一定的生物安全问题，且种植量有限，后续增殖、分化代数有限。包括伦理因素在内，都限制了干细胞作为组织工程阴茎海绵体的重要组成部分未来在临床的转化空间和前景。

研究显示，不使用外部种子干细胞的再生，称为无细胞再生，是解决这些细胞来源问题的一种很有前途的方法。外泌体作为细胞外囊泡（EV）的一个群体，携带多种细胞旁分泌的分泌物，包括蛋白质、RNA和脂质。自然产生的外泌体继承了起源细胞的生理特征。当在体内治疗时，外泌体与原始细胞治疗相比，显示出相当的效力和更好的安全性，这表明它们作为无细胞治疗的潜在用途。目前研究均表明外泌体在血管重塑中具有重要作用。

缺血组织中细胞行为的一个重要调节因子是缺氧微环境，而体外培养的肌源性干细胞通常暴露在21%的O2环境中，这与阴茎海绵体缺损后缺氧微环境的不一致。研究表明，缺氧预处理可增强干细胞的生物学功能，改善其治疗效果.

研究团队假设，H-Exos在阴茎海绵体组织工程中可以促进阴茎海绵体缺损的血管新生、恢复阴茎勃起及生殖能力。在这项研究中，研究团队比较了N-Exos和H-Exos对脐静脉血内皮细胞（HUVEC）的影响。此外，研究团队还确定了缺氧预处理是否会导致miRNAs的不同程度的表达，并研究了其对HUVEC的生物学效应和潜在的调节机制。最后，构建并移植含有H-Exos的EGCG改性的GelMA水凝胶海绵体支架，观察支架修复兔阴茎海绵体缺损的能力，以及恢复兔阴茎勃起和生育能力。

图1：兔海绵体损伤修复示意图

构建力学性能匹配、生物相容性良好生物支架

研究团队成功地使用3D打印技术制造了GelMA水凝胶支架。通过引入天然来源的氢键交联剂表没食子儿茶素（EGCG），在化学交联网络中添加氢键交联位点，改善了GelMA水凝胶的机械性能和生物相容性，使其更适合作为组织工程的支架材料。经EGCG修饰的GelMA水凝胶（GelMA-EGCG）的力学性能得到增强，抗拉强度提高9.4 倍（从0.05MPa提高到0.47MPa），断裂应变提高5倍（从22%提高到112%）。随着浸泡时间的增加，GelMA-EGCG水凝胶的压缩模量从0.021MPa增加到0.82MPa，浸泡24h后水凝胶的强度趋于稳定。GelMA-EGCG支架可以拉伸、弯曲和扭曲，表明GelMA-EGCG具有良好的机械稳定性，可以应用于阴茎这一高度动态的器官。在对照组、GelMA支架组和GelMA-EGCG支架组分别植入等量的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）。在24小时、 72小时和120小时后，使用荧光显微镜快速定量细胞活力。结果显示，三组细胞存活率均保持在90%以上，表明3D打印支架具有良好的生物相容性。

图2：3D打印EGCG修饰水凝胶支架的制备与表征

提取并验证低氧外泌体在促进血管生成的作用

研究团队前期已建立肌源性干细胞外泌体的提取和鉴定建立的体系。在该研究采用了常氧和低氧的培养条件，以获取常氧-MDSC来源的外泌体和低氧-MDSC来源的外泌体。为了进一步探讨H-Exos和N-Exos对HUVEC细胞增殖是否存在功能性差异，HUVEC被分别采用PBS、N-Exos或H-Exos进行处理。H-Exos组EdU阳性细胞的百分比中明显高于PBS对照组和N-Exos组。在CCK-8实验中，H-Exos展示出的OD值高于PBS对照组和N-Exos组，其中H-Exos组的增加最为显著。这些结果证实了外泌体的加入刺激了HUVEC的增殖，其中H-Exos的影响更为显著。研究团队检测了H-Exos及N-Exos在氧糖剥夺条件下对血管生成的影响。H-Exos显著抑制了HUVEC的凋亡。此外，H-Exos组的管状结构的长度显著高于其他两组。此外，H-Exos组的CD31、VEGF的相对mRNA表达量及CD31、VEGF的蛋白表达量显著高于其他两组。所有上述结果表明了H-Exos在促进血管生成中的显著作用。

图3：MDSC来源的低氧和常氧外泌体的鉴定及促进血管生成功能的评估

低氧外泌体通过过表达miR-21-5p和抑制PDCD4促进血管生成

为了研究H-Exos传递的miR-21 - 5p在促进HUVEC增殖、迁移、成管中的潜在作用机制，研究团队预测并验证了PDCD4可作为miR-21调控潜在靶标。接下来，研究团队检测了PBS、N-Exos或H-Exos处理的HUVEC细胞中PDCD4的表达水平。H-Exos处理后HUVEC细胞组中，PDCD4的mRNA水平和蛋白表达均显著降低。进一步，研究团队利用过表达PDCD4的HUVEC （OE-PDCD4），进一步研究了H-Exos与PDCD4的关联，结果显示，PDCD4的过表达可以抑制H-Exos处理后的HUVEC细胞的增殖和成管。过表达PDCD4后，H-Exos处理的HUVEC中VEGF和CD31的mRNA水平和蛋白表达水平显著下降。这些结果表明，低氧外泌体通过过表达miR-21-5p和抑制PDCD4促进血管生成。

图4：富含miR-21-5p的H-Exos通过靶向PDCD4的3′-UTR促进HUVEC细胞增殖、细胞迁移及成管

兔海绵体损伤模型的建立及缺损修复效果及勃起功能评估

接下来，研究团队构建了兔阴茎海绵体缺损模型。海绵体修复支架被植入模型兔的海绵体损伤部位。研究分组包括：阳性对照组（未进行手术操作）、阴性对照组（移除部分海绵体组织但未植入海绵体支架）、GelMA-EGCG组（不含外泌体）、N-Exos负载GelMA-EGCG组以及H-Exos负载GelMA-EGCG组。

每组在移植后28天，通过注射罂粟碱前后对海绵体动脉血流速度进行多普勒超声测量。如预期，与阴性对照组、GelMA-EGCG组和N-Exos负载GelMA-EGCG组相比，H-Exos负载GelMA-EGCG组的海绵体在移植后通过罂粟碱注射评估时显示出海绵体内血流的恢复。

磁共振成像（MRI）显示，与阴性对照组和GelMA-EGCG组相比，N-Exos加载GelMA-EGCG组和H-Exos负载GelMA-EGCG组在移植后28天显示出不同程度的受伤海绵体修复。从MRI三维重建图像来看，H-Exos负载GelMA-EGCG组可以在缺陷部位显著促进组织愈合和再生。这部分结果显示，将缺氧外泌体支架植入兔子阴茎海绵体的缺陷部位，可以显著恢复血供并促进缺陷修复。

阳性对照组、阴性对照组、GelMA-EGCG组、N-Exos负载GelMA-EGCG组和H-Exos负载GelMA-EGCG组在移植后14天和28天通过测量ICP/MAP值评估了勃起功能，在移植后14天，H-Exos负载GelMA-EGCG组的ICP/MAP比值高于阴性对照组。移植28天后观察到，H-Exos负载GelMA-EGCG组的ICP/MAP比值显著高于阴性对照组，接近于阳性对照组的水平。

图5：建立兔阴茎海绵体损伤模型并应用多普勒超声和磁共振成像评价修复情况

海绵体血管生成的组织学评估及雌雄兔同笼交配评估

在移植28天后，H-Exos负载GelMA-EGCG组的血管生成标志物α-SMA和CD31的免疫荧光染色密度高于阴性对照组、GelMA-EGCG组和N-Exos负载GelMA-EGCG组。这些结果也得到了苏木精-伊红染色图像的印证。

在含H-Exos的GelMA-EGCG组中，一只雌兔在同笼1月余后生下小兔。而在含N-Exos的GelMA-EGCG组中，在同笼2个多月后也成功生下小兔。在缺氧外泌体负载支架组和常氧外泌体负载支架组中出生的小兔表明，经过治疗的雄性兔子能够进行正常的勃起和射精。

图6：海绵体血管生成的组织学评估及雌雄兔同笼交配评估

持续创新、服务临床

在这项研究中，研究团队设计了一种具有良好力学性能和生物相容性的EGCG修饰的水凝胶支架，并将其作为H-Exos的载体；该生物支架应用于兔子缺损海绵体的修复，经过影像学检查、形态学评估、ICP等证实，该组织工程支架成功修复了海绵体缺损并恢复了阴茎的勃起和射精功能，使阴茎海绵体缺损的雄兔成功恢复了生育能力。

安庚教授团队2020年已构建了一种表面负载肝素涂层的具有多尺度多孔结构的仿生3D打印水凝胶支架，并向其中植入了HIF-1α突变的MDSC。在此基础上，为了克服干细胞作为种子细胞用于组织再生，面临着免疫排斥、增殖和分化受限，生物安全性等挑战，本研究进一步提出了一种有效的无细胞再生水凝胶支架修复阴茎海绵体缺损的治疗策略。这项最新研究证实了H-Exos联合GelMA-EGCG支架的阴茎海绵体组织的无细胞再生策略在修复海绵体缺损和恢复勃起和生殖功能方面具有重要的潜力，具有重要的临床转化价值。