错误剪接导致关键蛋白缺失，麻省大学科学家开发ASO药物治疗脆性X综合征，计划联合公司推进临床转化

脆性 X 综合征（fragile X syndrome，FXS），是一种 X 连锁显性遗传病，其发病率仅次于唐氏综合征，在男性中的发病率约为 1/4000，女性约为 1/6000~8000，男性发病率高于女性。

FXS 是引起遗传性智力低下和孤独症谱系障碍最为常见的单基因遗传病，其临床特征主要表现为中度至重度智力障碍、行为语言障碍，甚至癫痫等。针对 FXS，目前尚无有效治疗手段，虽然行为干预和语言训练对于一些轻症患者能够起到病情缓解作用，但就整体而言该病预后较差。

近日，来自麻省大学陈医学院的研究人员，开发的一种反义寡核苷酸治疗方法可以恢复从 FXS 患者身上采集的细胞样本中脆性 X 智力低下蛋白（FMRP）的产生，有望进一步开发成为治疗 FXS 的潜在疗法。目前，这项研究已经以“Antisense oligonucleotide rescue of CGG expansion–dependent FMR1 mis-splicing in fragile X syndrome restores FMRP”为题发表在 PNAS 上。

（来源：PNAS）

“这项发现为缓解和治疗脆性 X 综合征带来了真正的希望，并且有望能够比我们预计的更快的速度转化为临床应用。”该论文通讯作者、麻省大学陈医学院 Joel Richter 教授表示，“选定了一项好的基础科学研究，相信得到的数据并且遵循它，最终结果就有可能会改变我们对生物学和疾病的基本理解。”

Joel Richter 在美国亚利桑那州立大学获得博士学位，目前他是麻省大学陈医学院分子医学教授，Arthur F.Koskinas 神经科学教授。现阶段，他实验室的研究主要围绕细胞质多聚腺苷酸化对 mRNA 翻译控制的分子生物学以及这个过程对于一些生物学现象的影响，包括动物早期发育、细胞衰老/生长、神经元突触可塑性、学习和记忆、神经系统疾病等。

▲图｜麻省大学陈医学院 Joel Richter 教授（来源：UMass Chan Medical School）

发现剪接错误导致一种关键蛋白缺失

先前研究表明，脆性 X 综合征由位于 X 染色体的 FMR1（脆性 X 信使核糖核蛋白 1）基因突变所致。

具体而言，FMR1 基因 1 号外显子上的 5’非翻译区（UTR）有一段 CGG 三核苷酸串联重复序列，由于 CGG 三核苷酸重复扩增的动态突变和异常甲基化，造成其编码的脆性 X 染色体智力低下蛋白（FMRP）合成减少或缺失，从而导致脆性 X 综合征。

显微镜观察发现，含有重复扩增的 FMR1 基因呈狭窄带状，夹在 X 染色体的一个臂的顶端，由于这一部位易发生断裂，被称为“脆性位点”。

▲图｜相较于正常 X 染色体，脆性 X 突变的 X 染色体具有脆性位点（来源：UMass Chan Medical School）

据了解，FMR1 基因的 CGG 三核苷酸重复序列在正常人群中具有多态性。通常情况下，正常人体 FMR1 基因 CGG 重复次数在 5~45 之间；当重复次数在 46~54 之间称为“变异灰区”，虽然不会致病但是存在扩增风险；当重复次数在 55~200 之间为“前突变”，而当重复次数大于 200 则是“全突变”，临床表现为脆性 X 综合征，并且不论是“前突变”还是“全突变”，携带突变的女性将有一半概率会将变异遗传给下一代。

研究表明，FMRP 蛋白的主要功能是结合多达 1000 余种不同的 mRNA 并抑制其翻译。尽管现阶段尚不完全清楚 FMRP 如何调控 mRNA 翻译，但已知其在突触可塑性和大脑高级功能中发挥关键作用，FMRP 的缺失严重影响神经系统的正常发育。比如在 FXS 患者中，FMRP 的缺失会导致大脑过量产生数百种不同的蛋白质。

在这项研究中，研究人员基于 FXS 患者血液和组织样本并结合儿科、解剖学、神经科学等开展试验。“通过试验并观察各种 RNA 读数，我们惊讶地发现，FMR1 基因在很多 FXS 患者组织中转录，尽管这些白细胞和脑组织细胞没有制造蛋白质，但仍在产生 FMR1 mRNA，其实这是不应该出现的，这让我们开始重新思考这种疾病发生的分子生物学机制。”该论文第一作者、麻省大学陈医学院分子医学助理教授 Sneha Shah 说道。

▲图｜来自 FXS 患者的白细胞的基因表达变化和 FMR1 RNA 转录本的鉴定（来源：PNAS）

在很多神经系统疾病中，mRNA 的异常选择性剪接会导致基因表达失调。此次，他们发现 mRNA 在 FXS 患者的白细胞和脑组织中也出现了错误的表达和剪接，其表达一种异常剪接的 FMR1 转录亚型，他们将其称为 FMR1-217 RNA。

机制层面，他们发现在 mRNA 被翻译成功能蛋白之前经历了一个剪接的过程，在这个过程中去除了 RNA 的所有非编码区（内含子），并将蛋白质编码区（外显子）拼接在一起。这种选择性剪接能够使单个基因产生不同的 RNA 亚型，由于这些亚型各自包含不同的编码区，因此可以使单个基因制造多种蛋白质。

通过这项研究，他们在 FMR1 基因突变中发现的 CGG 重复序列导致了错误剪接，并在 mRNA 中留下了一个关键的内含子（假外显子）。正是由于这种剪接错误导致 FMRP 蛋白无法被生产，而非此前认为的基因甲基化。基于此，Joel Richter 和 Sneha Shah 推测，“如果把这种错误剪接进行纠正或避免，那么正常 FMRP 蛋白的生产就能够恢复。”

设计 ASO 并计划联合公司开发成新疗法

改变 RNA 剪接的一种方法是构建一个反义寡核苷酸（ASO）。ASO 其实是一个具有互补序列的短 DNA 片段，能够与靶 mRNA 结合，这种结合能够跳过 RNA 上不适当的剪接位点，从而恢复正常的剪接和成熟的 mRNA 形成。值得一提的是，这种策略已经在临床上用于治疗神经肌肉疾病脊髓性肌萎缩症（SMA），同时也正在开展针对其他神经系统疾病的临床试验。

为了设计出一种能够有效针对 FMR1 mRNA 的 ASO，Joel Richter 向麻省大学陈医学院生物化学和分子生物技术系的 Jonathan Watts 博士求助。

作为 ASO 领域专家，Jonathan Watts 长期专注于亨廷顿病（HD）和肌萎缩侧索硬化症（ALS）等神经系统疾病的研究，在此次针对 FXS 的新研究中，他设计出了 11 种 ASO，通过试验验证找到了 2 种 ASO 的组合，能够成功抑制患者来源细胞中 FMR1 mRNA 的异常剪接，使这些细胞能够产生正常的 FMRP 蛋白。

最终，研究人员通过使用 ASO 将 FMR1-217 RNA 拯救为正常剪接的 FMR1 RNA，从而恢复 FMRP 蛋白水平。

▲图｜以 FMR1-217 为靶点的 ASO 与 5-AzadC 结合可恢复 FXS 患者细胞中的 FMRP 水平（来源：PNAS）

“如果我们使用的是小鼠模型，那我们可能永远不会发现这一点。”Joel Richter 指出，“因为小鼠模型根本没有脆性 X 基因，所以没有产生 mRNA，FMR1 mRNA 的错误剪接是一种依赖于 CGG 扩增的基因调节机制，这或许是人类和灵长类动物所独有的。正是因为我们的这项研究是基于人类细胞，所以能够发现这种错误剪接。”Joel Richter 补充说。

现阶段，他和团队希望能够迅速将这一发现尽快转化为临床应用，因为目前 SMA 的治疗方法也是基于类似策略，只不过两者之间的区别为，这项研究是用于治疗 FMR1 mRNA 错误剪接的 ASO 基因序列。

对于临床转化，“这是一个非常令人兴奋的发现，具有很高的治疗潜力。然而，它现在仍处于早期发展阶段，还需要开展大量研究来确定这种 ASO 治疗策略如何有效地恢复 FMRP 蛋白的生产，比如在多少比例的脑细胞中，以及在哪些脆性 X 综合征患者中等等。如果这种 ASO 治疗策略在相当大比例的患者的细胞中获得成功，那么这将会对临床带来积极影响。”这项研究的参与者、芝加哥拉什大学医学中心儿科学系 Berry Kravis 说道。

接下来，该研究团队将与一家企业建立合作关系，这将有助于推动这种 ASO 治疗策略尽快进入临床试验阶段。