Science：利用PACE平台构建出更小的蛋白降解标签，用于精确触发细胞天然蛋白的降解

研究蛋白在健康和疾病中作用的科学家们使用实验工具使蛋白失活、破坏或阻止它们在细胞中产生。在一种方法中，人们用“消灭我”标签标记靶蛋白，这种标签与称为分子胶（molecular glue）的小分子一起作用，促使细胞自身的蛋白清除机制吞噬靶蛋白。然而，目前使用的许多标签太大，无法标记编码细胞天然蛋白的基因，或者会造成附带损害，引发除靶蛋白以外的蛋白破坏。

如今，在一项新的研究中，来自美国布罗德研究所的研究人员利用一种名为噬菌体辅助持续进化（phage-assisted continuous evolution, PACE）的平台生成了更小的蛋白降解标签，即锌指降解决定子（ZF degron）SD40，这类标签能形成分子胶水复合物，从而能够精确触发细胞自身蛋白的耗竭。相关研究结果发表在2024年3月15日的Science期刊上，论文标题为“Continuous evolution of compact protein degradation tags regulated by selective molecular glues”。

这些作者随后利用他们之前开发的一种名为“先导编辑（prime editing）”的基因编辑技术，将紧凑的ZF degrron插入到人类细胞的基因组中，在那里，它招募了细胞蛋白破坏途径的关键组成部分，即cereblon（CRBN），并在一种其他方面惰性的小分子（新型IMiD衍生物，比如PT-179）的存在下，迅速诱导靶蛋白降解。

这些作者解析出CRBN•IMiD•ZF三组分复合物的三维结构，对它的活性和特异性提出新的见解，还进化出了能在小鼠细胞中发挥作用的ZF degrron变体。该平台有可能进化出更多新的ZF degrron和分子胶复合物，以便用于探索蛋白功能或验证治疗靶点。

论文共同通讯作者、布罗德研究所梅金医疗保健变革技术研究所主任David Liu说，“我们证实持续进化是一种强大的方法，可以快速进化出可成为有用的研究工具的分子胶系统。我们很高兴看到这种方法还能应用于进化以创造性和强大的方式与小分子相互作用的其他蛋白。”

新的分子胶水突破

这项新的研究基于今年早些时候发表的、由论文共同通讯作者Amit Choudhary领导的一项研究（Nature Chemistry, 2014, doi:10.1038/s41557-023-01379-8）。那项研究发现了一些与沙利度胺（thalidomide）有关的分子，其中沙利度胺是一种典型的分子胶水，能与CRBN相互作用引发靶蛋白降解，被用于治疗某些癌症和皮肤病。沙利度胺会引发大量蛋白的破坏，而一种名为PT-179的相关分子却相对惰性，这使它成为更精确分子胶系统的良好起点。

在这项新的研究中，这些作者利用Liu 于2011年在哈佛大学开发的PACE平台（Nature, 2011, doi:10.1038/nature09929），生成了一种可能与PT-179配合使用的ZF degrron。PACE允许人们快速进化出具有有用特征的新蛋白。

在由论文共同第一作者Jaron Mercer和Stephan DeCarlo领导的实验中，这些作者从锌指（ZF）基序入手，其中ZF基序是一种已知能与分子胶结合的CRBN接合的蛋白结构元件。经过 PACE 期间数百代的进化，他们进化出了新的ZF结构域，它能与与PT-179 分子胶水结合的CRBN相互作用。他们随后将这个ZF结构域缩减到 36 个氨基酸，并将它命名为 SD40。

进化的锌指介导经过标记的内源性蛋白的特异性降解

图片来自Science, 2024, doi:10.1126/science.adk4422

DeCarlo说，“我们希望找到尽可能小的ZF基序，这样就能利用我们的先导编辑技术，有效地标记基因组中的内源基因。研究内源调控控制下的蛋白缺失是生物学的一大目标，这不仅是为了验证药物靶点，也是为了研究生物学中的天然蛋白功能。”

随后，他们利用先导编辑技术将SD40插入人体细胞的基因组，并标记两种不同的蛋白。在加入 PT-179仅几分钟后，这两种经过标记的靶蛋白就开始从细胞中消失，而对数千种非靶蛋白的评估均未观察到任何影响。

Mercer说，“其他系统显示的是细胞外来蛋白的降解，但是使用我们研发的这种强效标签，我们显示的是细胞内天然靶蛋白的降解，这在生物学上更有意义。”

为了深入了解SD40、CRBN和PT-179是如何相互作用的，这些作者在论文共同第一作者Shourya Roy Burman的领导下分析了这种三组分复合物的三维结构。

这些作者利用低温电镜显示，当CRBN与SD40和PT-179结合时，CRBN处于封闭构象，SD40似乎将CRBN的两端固定在一起。它表明，CRBN可能需要“封闭”，以便向这种三组分复合物中的其他蛋白传递信息，标记靶蛋白并使其遭到破坏。

由于人体细胞和小鼠体内降解蛋白的细胞机制不同，这些作者还利用他们的方法进化出了一种能与小鼠细胞中的CRBN结合的ZF degrron，这在涉及人类疾病转基因小鼠模型的研究中可能很有用。

PACE平台还可能能够用于进化具有新型ZF degron的分子胶复合物，或一组以新的有趣方式相互作用的其他蛋白。

这些作者已与癌症生物学和其他领域的科学家们合作，利用他们进化出的ZF degron来标记具有潜在治疗意义的蛋白。这种方法使得他们能够通过添加 PT-179 在几分钟内移除靶蛋白，同时保留相应基因的天然基因组环境，从而最大限度地减少对许多蛋白的天然生物功能至关重要的调控机制的干扰。（生物谷 Bioon.com）

参考资料：

Jaron A. M. Mercer et al. Continuous evolution of compact protein degradation tags regulated by selective molecular glues. Science, 2024, doi:10.1126/science.adk4422.

Scientists generate new targeted protein degradation system that tunes a cell's own proteins
https://phys.org/news/2024-03-scientists-generate-protein-degradation-tunes.html