Nat Biotechnol | 王潇/刘如谦合成具有核酸外切酶抗性的枝状poly(A)尾，提高mRNA药物稳定性

信使RNA (mRNA)疗法最近因其可编程性、可扩展性和易于设计和合成而备受关注，2019年冠状病毒病(COVID-19) mRNA疫苗的快速发展证明了这一点。例如，mRNA已在早期临床试验中用于产生旁分泌血管内皮生长因子(一种用于治疗心力衰竭的蛋白质)和用于纠正导致杂合性家族性高胆固醇血症的突变的Cas9蛋白。用于酶替代、抗体治疗和基因编辑等应用的mRNA治疗需要持续的高水平蛋白质生产，但传统的mRNA药物存在RNA不稳定和低表达效率的问题，需要高剂量，可能导致细胞毒性。为了应对这些挑战，有必要努力提高mRNA载体的翻译持续时间和整体蛋白质产量。

为了扩大mRNA药物的应用范围，人们做出了许多努力。用N1-甲基伪尿嘧啶(m1 ψ)替代尿嘧啶(U)通过阻断toll样受体识别降低免疫毒性。非翻译区(UTRs)的密码子优化和序列操作已被证明可以增加蛋白质表达。一种有望扩大mRNA药代动力学窗口的策略是使用环状RNA (circRNA)，它对外切酶切割具有抗性，而外切酶切割是线性mRNA降解的主要途径。然而，circRNA技术在目前的状态下面临着一些限制。circRNAs的翻译起始依赖于内部核糖体进入位点(IRES)，其效率低于7-甲基鸟苷酸(m7G)帽依赖的翻译起始机制。

circRNA限制了化学修饰的使用，包括m1 ψ，因为它们阻断了circRNA合成所需的RNA剪接，并消除了基于IRES的翻译起始。类似的限制适用于自我扩增的RNA，其中复制响应保守序列元素与m1 ψ和生成的复制子是无帽的，具有免疫原性。因此，需要其他策略来保护mRNA转录物免受核酸外切酶依赖的快速衰变，特别是3' poly(A)尾部的死基化，同时保留有效的帽依赖翻译起始机制。

支链化mRNA的合成及筛选流程（Credit: Nature Biotechnology）

在最广泛接受的帽依赖翻译机制模型中，限速步骤是真核翻译起始因子(eIF4E和eIF4G24)组装以m7G帽为中心的翻译起始复合物。翻译起始复合物通过eIF4G与细胞质poly(A)-binding protein (PABPCs)的相互作用进一步稳定，后者识别3 ' poly(A)尾部，形成多聚体复合物和闭环结构。PABPCs具有双重作用，通过与eif结合启动翻译，并通过掩盖poly(A)尾部以防止死乙烯化来延长mRNA的稳定性。

之前已经证明，在poly(A)尾部引入位点特异性的抗外切酶修饰，可能通过稳定新生的poly(A)尾部和维持poly(A) -PABPC1相互作用，有效地增加了纤维素中mRNA的稳定性和蛋白质的产生。结构研究表明，PABPC1是一种多聚体蛋白复合物，其中单个PABPC1分子结合poly(A)尾部形成稳定的宏观结构。

为了实现上述目标，作者开发了具有多聚(A)尾部的化学修饰，帽状，分支的mRNA寡核苷酸偶联物，称为多尾(multitail) mRNA。系统地评估了poly(A)尾部不同的化学和拓扑模式对mRNA翻译能力的影响及其作用机制。已经在细胞系和小鼠中成功构建了可延长蛋白表达长达14天的支链mRNAs，并在最小剂量下提高了聚集规律间隔短回文重复(CRISPR)编辑效率。从RNA生物化学的更广泛的角度来看，该研究提供了一种可推广的方法，将定义的但不同的修饰引入到poly(A)尾部，并表明这些化学和拓扑模式被mRNA翻译机制很好地耐受。