Nat Biotechnol | 北京大学伊成器等团队合作开发同时对5mC和5hmC进行单细胞分析的新方法

基因组的动态化学修饰，包括组蛋白尾部和DNA碱基，通过促进或抑制转录因子与它们的结合来调节基因表达。DNA 5-甲基胞嘧啶(5mC)是一种主要的表观遗传修饰，在DNA甲基转移酶和复制依赖或复制独立的去甲基化过程的驱动下，以细胞类型特异性的方式沉积或消除。复制无关的活性DNA去甲基化由TET家族蛋白介导，依次产生5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)、5-甲酰基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)，后两种形式的碱基切除修复以重新安装未修饰的胞嘧啶。5mC和5hmC都被证明在哺乳动物中调节多种生物过程，包括干细胞多能性、发育、衰老和肿瘤发生。

各种分子检测方法被开发出来，用于识别许多细胞类型和物种中调控元件的位置和状态。最近在单细胞基因组学中发展起来的方法通过获取基因表达、染色质高阶组织、染色质可及性、组蛋白修饰和DNA碱基修饰，在复杂生物系统的单细胞分辨率下一次或一起进行一种模式，彻底改变了基因调控网络的研究。特别是，开创性的单细胞甲基组分析揭示了5mC在不同细胞环境中的异质性和细胞类型特异性模式。

然而，亚硫酸盐处理依赖的方法不能从5mC中分离出5hmC，从混合输出中模糊了它们各自作用的功能解释。利用糖基化5hmC (5ghmC)依赖的限制性内切酶AbaSI，最近开发了在单细胞中定位5hmC的方法。开始深入了解5hmC的分布模式和生物学功能，并暗示其与其他表观遗传层，特别是5mC的关系的潜在意义。然而，一次测量这两种修饰只能捕获不同细胞群体的平均结果，而潜在的异质性关系，如在动态细胞系统中5mC和5hmC的产生所贡献的DNA甲基化平衡，可能会丢失。

SIMPLE-seq原理图（Credit: Nature Biotechnology）

5mC和5hmC单细胞联合谱的主要挑战是从同一DNA分子中正交记录两种模式。为了解决这个问题，DNA模板应该被最小程度地破坏;因此，最近开发的无亚硫酸盐化学标记方法-例如，TET辅助吡啶硼烷测序(TAPS)和化学辅助5hmC测序的C-to-T转化(hmC-CATCH) -对5mC或5hmC温和且特异性的方法提供了潜在的机会。然而，目前的两种方法不允许正交记录两种修饰，因此不能直接相互兼容：阻断TAPS43中的5hmC模式，这保证了5mC检测的特异性，将使5hmC无法进一步标记和检测。

该研究提出SIMPLE-seq(通过测序同时分析表观遗传胞嘧啶修饰)，用于在单细胞和单碱基分辨率下联合分析5mC和5hmC。SIMPLE-seq基于无亚硫酸盐化学标记反应的组合，顺序引入5mC和5hmC的“C-to-T”突变信号，并检测单个细胞中来自同一DNA分子的修饰的位置和类型。将SIMPLE-seq应用于小鼠胚胎干细胞(mESCs)、人外周血单个核细胞(PBMCs)和小鼠脑样本。在单细胞和单分子水平上对5mC和5hmC联合图谱进行综合分析，揭示了不同细胞状态和调控元件的不同表观遗传程序。