研究人员实现RNA定点高效乙酰化修饰

4月13日，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心研究员周小龙团队，在《核酸研究》（Nucleic Acids Research）上以Activity reconstitution of Kre33 and Tan1 reveals a molecular ruler mechanism in eukaryotic tRNA acetylation为题发表研究论文。该研究成功重组真核生物细胞质tRNA乙酰化修饰活力，揭示乙酰化修饰酶复合物Kre33-Tan1对底物的专一性识别机制，实现tRNA及小RNA分子上的定点高效乙酰化修饰。

在细胞内所有RNA分子中，tRNA含有最为密集且种类最为多样的转录后修饰。目前，主要发现2种RNA乙酰化修饰种类，即N⁴-乙酰胞苷(ac⁴C)及N⁶-乙酰腺苷(ac⁶A)。ac⁴C在三界生物以及病毒来源的多种RNA中广泛存在，而ac⁶A只存在于古细菌来源的tRNA中。20世纪60年代，ac⁴C首先在真核生物的tRNA^Ser、tRNA^Leu以及细菌延伸tRNA^Met【tRNA^Met(e)】中被鉴定。

在细菌tRNA中，ac⁴C特异性地存在于tRNA^Met(e)反密码子第一位（第34位，ac⁴C34）。ac⁴C34活力重组、结构解析以及遗传学数据表明，TmcA以及TmcAL蛋白质通过两种不同的机制，分别利用乙酰辅酶A或乙酸作为乙酰供体，催化tRNA^Met(e) ac⁴C34的生物合成。ac⁴C34可以阻止tRNA^Met(e)的CAU反密码子与异亮氨酸AUA密码子的配对，防止AUA密码子被解码为甲硫氨酸，从而确保了细菌蛋白质合成的精确性。就真核生物tRNA而言，ac4C专一性地存在于第12位（ac⁴C12）。虽然发现于上世纪60年代，直到2004年，Tan1被发现参与ac⁴C12形成，但是Tan1没有催化活性中心，被认为是一个RNA结合蛋白质。2015年，真核生物tRNA ac⁴C12修饰酶Kre33才被鉴定。Kre33主要定位于核仁，是rRNA前体加工成熟的辅助因子。近年来，人THUMPD1（Tan1同源蛋白质）系列点突变导致出生缺陷型神经发育异常。长期以来，真核生物tRNA ac⁴C12修饰从未被成功重组，导致ac⁴C12生物合成的分子基础、底物识别机制、相关疾病的分子机制等完全未知，也无法基于修饰机器在特定RNA分子上实现定点乙酰化修饰。

该研究通过分析核糖体亚基前体剪接复合体中的Kre33结构，结合AlphaFold预测的Tan1结构，合理设计表达质粒，获得高纯度的Kre33与Tan1蛋白质；通过条件优化，利用乙酰辅酶A作为乙酰化供体，实现tRNASer以及tRNA^Leu上的高效乙酰化修饰；系统研究Kre33-Tan1识别tRNA底物的识别机制，提出真核生物tRNA乙酰化修饰的“分子标尺”模型；在特定tRNA底物上实现100%乙酰化修饰效率，实现多种非乙酰化tRNA底物变体的高效乙酰化修饰；基于“分子标尺”模型，实现小RNA的位点特异性高效乙酰化修饰；通过制备乙酰化修饰的tRNA^Ser以及tRNA^Leu，揭示乙酰化修饰对于tRNA的热动力学以及氨基酰化水平没有显著影响，可能在翻译延伸的转位过程中介导了tRNA与核糖体的相互作用。

该研究重组真核生物tRNA乙酰化修饰活力，提出乙酰化修饰酶复合物Kre33-Tan1识别底物的“分子标尺”模型，实现tRNA与小RNA分子上的定点高效乙酰化修饰。研究加深了对真核生物tRNA乙酰化修饰的分子机制的认识，开发了特定RNA分子定点乙酰化修饰工具，有助于进一步研究RNA乙酰化修饰的机制与生物学功能，包括鉴定潜在的乙酰化修饰的“阅读器”和“擦除器”。

研究工作得到科学技术部、国家自然科学基金委员会、中国科学院、上海市科学技术委员会的支持。

真核生物tRNA乙酰化修饰的实现与机制