单个外泌体表征分析技术2022年Nano Letters盘点丨助力MSC外泌体、单外泌体亚群分析的研究！

外泌体是包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡，是细胞间信号传输的载体。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，它们广泛存在于血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等体液中，参与细胞间通讯。近年来，外泌体的研究热度持续攀升，在2019年国家自然科学基金获批项目中，外泌体研究相关项目的总数突破500个，立项的总金额突破2亿元。但由于外泌体的尺寸（30~200 nm），常规的光学显微镜无法对其进行成像分析，因此很少有技术能够对单个外泌体进行物理表征和蛋白分型。

美国NanoView Biosciences公司推出了全自动外泌体荧光检测分析系统ExoView，系统，采用了独特的SP-IRIS成像技术，只需要少量样品即可一次完成外泌体计数、粒径、蛋白表达、蛋白共定位、亚群分布的分析。全自动外泌体荧光检测分析系统ExoView于2018年被推出后，便引起了外泌体领域科研工作者的广泛关注，目前在全球已近100多个实验室采用该技术，发表文献超过180篇。进入2022年，使用ExoView发表的论文出现井喷性增长，短短数月已经发表了超过88篇。本文选取了两篇在知名高水平期刊《Nano Letters》发表的比较有代表性的文章，来说明ExoView在间充质干细胞（MSC）、单外泌体亚群分析等研究领域的具体应用。

脊髓损伤（SCI）是脊柱损伤最严重的并发症，是人类健康最严重的威胁之一。早先研究已证明间充质干细胞(MSC)来源的外泌体在SCI治疗中方面具有巨大的应用潜力。然而，传统的二维（2D）培养模式会导致间充质干细胞的干细胞特性丧失，从而影响间充质干细胞来源的外泌体（2D-Exo）的治疗性能。三维培养模式产生的外泌体（3D-Exo）具有更高的治疗效率，因此其在脊髓治疗中也有着更为广泛的应用，但之前的相关报道极少。另外，传统的外泌体治疗通常依赖于局部的反复注射，遗憾的是这种方法由于清除速率很快导致治疗效率低下，并且也可能会导致对脊髓的二次损伤。因此，开发一种更加可靠、方便和有效的外泌体递送方法，以实现稳定的原位外泌体释放成为新的研究方向。近日，韩敏等[1]开发了一种可控的3D外泌体水凝胶混合微针阵列贴片以实现SCI原位修复。

其中，研究人员使用甲基丙烯酰化明胶（GelMA）混合3D培养的MSC来源的外泌体构建了用于微针阵列贴片，并用ExoView对2D-Exo和3D-Exo进行了检测。2D-Exo和3D-Exo的亚群计数结果显示，具有CD81+或（和）CD9+跨膜蛋白的外泌体数量最多（图1 A和B）。2D-Exo和3D-Exo的荧光强度分布如图1 C和D所示。荧光共定位分析结果显示3D-Exo富含同时表达CD81+CD9+的外泌体（图1 E、F、G、H）。此外，MSC-Exo粒径的统计分析表明，2D-Exo的CD9+外泌体的平均粒径为67±22nm，2D-Exo的CD81+外泌体的平均粒径为70±25nm（图1 I和J），3D-Exo的CD9+外泌体的平均粒径为60±15nm，3D-Exo的CD81+外泌体的平均粒径为59±14 nm（图1 K和L）。总体而言，3D-Exo粒径更小，更容易被靶细胞吞噬。荧光成像结果显示，3D-Exo中CD81和CD9的荧光强度显着高于2D-Exo（图1 M和N )。

图1 ExoView检测2D-Exo和3D-Exo的亚群数量、荧光强度、共定位、粒径分布以及进行荧光成像

由于外泌体在诊断和治疗领域具有巨大潜力，因此单外泌体水平检测一直是研究热点。目前大多数的外泌体分析技术主要基于成像，但是较多成像技术检测的粒子数量级有限，很难实现临床样本的高通量检测（大于108 EV/ml）。此外，单一平台实现检测灵敏度达到单外泌体水平、区分外泌体的不同亚群特异性以及高通量分析非常具有挑战性。近期Zijian Yang等[2]发明了一种高通量数字测定法，这是一种基于液滴可以对特定的单外泌体亚群进行高通量量化分析的光流控平台（DEVA）。

其中，研究人员使用ExoView对来源于人类神经元的外泌体进行分析，对开发的DEVA系统进行评估。ExoView可以通过免疫捕获和荧光标记对外泌体进行分析，红色荧光抗体代表CD63，绿色荧光抗体代表CD81，蓝色荧光抗体代表CD9（图2 A和B）。亚群计数结果显示CD81+外泌体数量显着高于CD63+或CD9+外泌体（p<0.05，p<0.0001），也显着高于MIgG阴性对照（p<0.0001)（图2 C）。CD81+外泌体的荧光共定位分析显示每个标记组代表一个不同的外泌体亚群，互相没有交集，其中只标记CD81荧光抗体的外泌体数量最多，其次是只标记CD63荧光抗体和同时标记CD63CD81荧光抗体的外泌体（图2 D）。另外，在CD81+外泌体中，67% (64.3%-69.8%) 的外泌体同时共表达了另一个CD81蛋白（荧光标记）（图2 E）。因此，研究人员选择使用CD81进行捕获和标记，而不是使用神经元特定的表面蛋白标记物，这样能够量化和校准DEVA的性能。

图2 ExoView的原理示意图以及ExoView检测人类神经元的外泌体的亚群数量、共定位和进行荧光成像