渐冻症患者诱导多能干细胞建立了新的神经肌肉类器官疾病模型

来源：网络 2024-05-23 12:00

研究人员相信该模型能够用于未来ALS或者其他神经肌肉接头类疾病的药物测试及相关分子机制的研究。

西湖大学雷凯团队在Cell Reports在线发表了题为“Neuromuscular organoids model spinal neuromuscular pathologies in C9orf72 amyotrophic lateral sclerosis”的研究成果。

该研究报道了一种利用患者诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）构建神经肌肉类器官（Neuromuscular Organoids, NMOs）的方法，用于研究渐冻症（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）的体外疾病模型。研究团队使用C9orf72突变的ALS患者的iPSCs，成功地诱导出NMOs。这些NMOs模拟了包括骨骼肌收缩障碍，神经肌肉接头退化和蛋白异常堆积等疾病相关的病理特征。同时，研究团队还展示了这种类器官模型对测试ALS治疗药物的功效。

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渐冻症即肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS），是一种多因素共同作用的神经退行性疾病，其主要特征是运动神经元的退行性改变。一般情况下，ALS患者的生存年限不超过两年，仅有10%的患者存活超过5年。目前已确定与ALS发病直接相关的基因有30多种，而家族性患者仅占总病例数的约10%。这些因素限制了小鼠等动物模型的开发，从而限制了ALS的机制研究与药物研发。因此，开发新的能模拟疾病表型且满足高通量筛选的体外疾病模型，对于ALS及其他神经退行性疾病的治疗手段的开发将起到巨大作用。

研究人员利用C9orf72（C9-ALS）患者iPSCs作为模型（C9n1，C9n6，C9n3），经CRISPR/Cas9介导的突变修正iPSCs作为对照（C9n1ISO，C9n6ISO），通过定向诱导手段，构建了神经肌肉类器官（NMOs），用于研究ALS。研究人员发现，NMOs具有与渐冻症神经肌肉退行性病理改变相对应的细胞与组织结构，包括运动神经元、中间神经元、神经胶质细胞、骨骼肌和神经肌肉接头等。

图1. C9orf72-iPSCs构建形成神经肌肉类器官

基于ALS临床症状，研究人员发现使用C9-iPSCs培养至第100天的NMOs，在骨骼肌侧观察到明显的神经肌肉接头（Neuromuscular Junction, NMJ）退化现象（图2）。研究结果还显示，在这个时间点，来自ALS患者的NMOs在骨骼肌收缩频率方面，无论在基础状态还是加入谷氨酸刺激后，均显著低于对照组。这些结果表明，患者来源的NMOs能够模拟ALS中与骨骼肌失神经和功能失调等病理特征相关的现象。

图2. C9orf72-NMOs对ALS相关的骨骼肌失神经的模拟

C9orf72基因突变是其外显子1中插入了高度重复 (GGGGCC)n序列，该重复序列的异常转录及翻译导致细胞核中形成RNA foci，细胞质中形成二肽重复序列蛋白（DPRs）异常聚集。研究人员发现C9-NMOs神经元和胶质细胞中存在RNA foci在细胞核的聚集，以及C9orf72相关的DPRs蛋白PolyGA在细胞质的异常聚集（图3）。这些发现证实，患者来源的NMOs能够模拟C9orf72突变型ALS患者神经组织中的特定病理指征。

图3. C9orf72-NMOs对其特异性病理指征的模拟效应

为了进一步研究NMOs对ALS神经退行性病理学特征的模拟效应，研究人员测试了神经元和胶质细胞中与自噬相关的蛋白P62的分布情况（图4A-C）。研究发现，来自C9-iPSCs的NMOs中，神经元和胶质细胞中出现了明显的P62蛋白堆积，提示该模型表现出与ALS相关的神经组织退行性改变。此外，为了进一步研究ALS来源的NMOs中神经功能的改变，研究人员通过钙成像手段测试了神经元的电生理变化（图4D-I）。钙成像实验结果显示，C9-iPSCs来源的NMOs出现了明显的钙信号下降。综上所述，这些结果表明NMOs能够有效模拟与ALS相关的神经退行性改变。

图4. C9orf72-NMOs对ALS相关的神经退行性改变的模拟效应

随后，为了进一步探索NMOs是否能够作为药物研究及筛选的工具，研究人员使用PERK抑制剂GSK2606414对C9-NMOs进行处理。通过评估发现，GSK2606414能够有效降低C9-NMOs中DPRs的堆积及自噬现象，并显著改善了骨骼肌侧的收缩功能，并发现该效应还受到给药时间和剂量的影响。

综上所述，研究团队建立了一种能够模拟ALS患者躯干脊髓神经系统及外周骨骼肌病变的类器官模型。研究人员相信该模型能够用于未来ALS或者其他神经肌肉接头类疾病的药物测试及相关分子机制的研究。

西湖大学生命科学学院的研究员雷凯为本文的通讯作者；原西湖大学博士后、现浙大城市学院副教授高充为本文的第一作者。其他合作者还包括西湖大学的石清华、潘雪、陈佳佳、文杉、张玉红、郎佳丽，西湖大学研究员刘晓东，复旦大学脑科学转化研究院研究员程田林；课题得到了浙江省“尖兵领雁+X”研发攻关计划、西湖实验室（生命科学和生物医学浙江省实验室）、国家自然科学基金，西湖大学教育基金会、上海市自然科学基金和科技计划项目的资助；项目实施还得到了西湖大学生物医学实验技术中心、西湖大学裴端卿实验室、常兴实验室、马丽佳实验室、南京医科大学刘妍实验室、德国柏林Max Delbrueck 分子医学中心Mina Gouti团队的支持与帮助。

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