Nature Biotechnology：ENTER问世！会“变身”的弹性蛋白纳米粒，打破细胞递送壁垒，蛋白、核酸一网打尽

细胞递送的难题：药物如何跨越细胞壁垒？

细胞外面有一层坚固的细胞膜，细胞内部还有层层“关卡”。大分子药物进入细胞通常依赖于内吞作用 (endocytosis)，细胞膜会像吞噬泡一样将药物包裹起来，形成内涵体 (endosome)。问题是，内涵体随后会逐渐酸化并与溶酶体融合，很多药物在内涵体里就被降解了，还没来得及发挥作用。所以，药物需要想办法从内涵体中“逃逸”出来，进入细胞质（cytosol），这被称为内涵体逃逸 (endosomal escape)。这是一个巨大的挑战，也是许多潜在疗法难以实现的瓶颈。

ENTER登场：弹性蛋白纳米粒的自组装魔力

这项研究的研究人员将目光投向了一种天然蛋白质——弹性蛋白。弹性蛋白基多肽（Elastin-like polypeptides, ELPs）是由一种简单的重复肽段序列 (VPGXG) 组成的重组蛋白聚合物。它的奇妙之处在于具有热敏性 (thermally responsive)：在低温下可溶，但温度升高到一定阈值（相转变温度，T_t）以上时就会发生相分离，形成聚集体或胶束（micelles）。

研究团队利用ELPs的这一特性，设计了一种四嵌段ELP聚合物。想象一下它像一列有不同车厢的“列车”：一个亲水块 (hydrophilic block)作为“车头”，让纳米粒在水溶液中稳定；一个交联块 (cross-linking block)便于后续修饰；最重要的，一个疏水块 (hydrophobic block)作为“货舱”，以及一个特殊的内涵体逃逸块 (Endosomal Escape Peptide, EEP)作为“秘密武器”。当ELPs浓度超过一定值，并且温度适宜时（比如我们的体温37℃），这些ELP链就会自组装，亲水块朝外形成纳米粒的“外壳”，疏水块和EEP则藏在“核心”。

迭代优化：构建“聪明”的细胞快递员

研究团队的ENTER系统不是一蹴而就的，而是经过了四代（V1到V4）的迭代设计。

V1-ELP： 最早的ELP系统，主要用于细胞外的药物递送，可以通过sortase酶（一种细菌转肽酶）将带有LPETG序列的蛋白连接到ELP上。实验显示，V1-ELP形成的纳米粒直径约60纳米，能被HeLa和HEK293细胞内吞，但需要氯喹（chloroquine，一种已知能促进内涵体逃逸的药物）的帮助才能实现蛋白递送（荧光蛋白递送效率在氯喹辅助下从接近0%提升到接近30%）。这表明V1-ELP能进入细胞，但内涵体逃逸能力不足。

V2-ELP： 为了增强内涵体逃逸，研究者在ELP的疏水块中引入了组氨酸（histidine）。组氨酸在酸性环境下会质子化，增加亲水性。他们的设想是，当纳米粒进入酸性的内涵体时，组氨酸质子化会导致“货舱”的疏水性降低，“列车”解体，从而帮助“货物”逃逸。V2-ELP在pH值低于6时确实显示出胶束解体的现象。在HEK293-RFP（含有loxP-stop-loxP-RFP基因，Cre重组酶介导重组后会表达红色荧光蛋白RFP）细胞中，V2-ELP递送Cre蛋白（一种介导基因重组的酶，可用于验证细胞递送效率）的能力比V1-ELP有所提升，尤其是在氯喹存在的条件下（RFP阳性率从约10%提升到超过50%），这证实了组氨酸的作用，但仍需要氯喹辅助。

V3-ELP： 进一步引入了EEPs。研究者在V2-ELP的N端（亲水块的“车头”）融合了五种不同的EEPs，包括Tat、S10等已知的内涵体逃逸肽。这些V3-ELP能形成稳定的纳米粒。在HEK293-RFP细胞中测试递送Cre蛋白时，带有S10或Tat EEP的V3-ELP效率最高，可以在浓度为16微摩尔ELP时实现约30%的RFP阳性率，但在这个浓度下观察到一定的细胞毒性。同时，他们还测试了不同的蛋白连接子（linker），发现一种对弗林蛋白酶（furin）敏感的连接子（GGSGGSRVRRGGSGGS）能提高Cre蛋白释放效率，这是因为弗林蛋白酶在内涵体中活跃。然而，N端融合的EEP暴露在外，可能会导致细胞膜破坏，从而产生毒性。

V4-ELP： 为了降低毒性并更好地利用EEP，研究团队进行了关键的改进。他们将EEP移到了ELP的C端（疏水块的“车尾”），这样在自组装成纳米粒时，EEP会隐藏在疏水核心内部，被亲水外壳屏蔽。他们推测，只有当纳米粒进入内涵体、组氨酸质子化导致“货舱”解体后，藏在内部的EEP才会暴露出来，发挥内涵体逃逸功能，从而降低对细胞膜的非特异性破坏。同时，为了避免C端带正电的EEP与N端带负电的亲水块之间的静电吸引影响自组装，他们将N端亲水块中的谷氨酸（glutamic acid，带负电）替换成了丙氨酸（alanine）和甘氨酸（glycine），形成了新的V4-ELP结构。V4-ELP形成了直径约70纳米的单分散球形胶束纳米粒，负染透射电镜图像也显示了约30纳米的球形颗粒。

打开细胞大门：内涵体逃逸肽的寻觅与突破

尽管V3-ELP中的S10等EEP已能提高递送效率，但毒性仍是限制。V4-ELP的设计理念正是为了屏蔽EEP毒性。为了找到更强大的EEP，研究团队进行了一次大规模的计算模拟 (in silico screening)和体外筛选 (in vitro screening)。

他们首先构建了一个机器学习模型，基于已知内涵体逃逸肽的理化性质、结构特征和组成（如疏水矩、净电荷、两亲性α螺旋等），预测其递送效率。这个模型在测试数据集上的均方根误差（r.m.s.e.）为12.4，预测效果良好。随后，他们利用这个模型筛选了一个包含超过11000个α螺旋肽段的数据库。第一轮筛选发现一些候选肽段（如EEP5），但它们在V4-ELP平台上的Cre蛋白递送效率不如S10（S10在8微摩尔ELP浓度下使约44.1%细胞RFP阳性，EEP5仅约25.7%）。注意到表现较好的EEP（如EEP1和EEP5）富含赖氨酸（lysine），这可能是一个重要线索。

受此启发，他们进行了第二轮基于模型的筛选，重点寻找富含赖氨酸的α螺旋肽段。这次筛选取得了重大突破！他们发现了EEP13和EEP14等几个候选肽段，在V4-ELP平台上递送Cre蛋白的能力显著优于S10。尤其是EEP13，是一种由两个合成的抗菌肽组成的二聚体（通过GGSGGGS连接）。在HEK293-RFP细胞中，V4-ELP-EEP13在低至100纳摩尔的Cre蛋白剂量下（同时使用8微摩尔ELP）就展现出卓越的递送能力。单独比较V4-ELP-S10和V4-ELP-EEP13在不同ELP浓度下的性能，V4-ELP-EEP13显示出更高的最大递送效率。相较于基准肽S10，EEP13在计算模型预测的GFP递送效率上提升了48%。这项发现印证了通过屏蔽EEP毒性来发现更高效EEP的策略是可行的。

研究团队还通过用巴弗洛霉素A1（bafilomycin A1，一种抑制内涵体酸化的药物）预处理细胞的实验证实，ENTER递送Cre蛋白的效率会显著降低，这强有力地支持了ENTER的内涵体逃逸机制依赖于内涵体酸化和组氨酸的质子化。

精准投递：蛋白质与基因编辑工具的实验成果

确定了优秀的纳米粒设计（V4-ELP-EEP13）和高效的EEP，接下来就是看它的实际递送能力了。

蛋白质递送：

HEK293细胞： V4-ELP-EEP13递送Cre蛋白的效果优于单独的S10肽段（在相似RFP阳性率下，所需ELP剂量比单独S10肽段低20倍以上）。与商品化的脂质体转染试剂Lipofectamine 3000相比，V4-ELP-EEP13在递送Cre蛋白方面表现相似甚至更优。这表明ENTER是蛋白质胞内递送的有效载体。

原代细胞： 递送系统能否用于原代细胞是衡量其潜力的关键。研究团队在多种原代细胞中测试了V4-ELP-EEP13递送Cre蛋白的能力，这些细胞来自报告小鼠（Ai9小鼠，Cre重组酶介导基因重组后会表达红色荧光蛋白tdTomato）：

肺成纤维细胞 (lung fibroblasts)： ELP和Cre蛋白共处理后，tdTomato阳性细胞比例呈剂量依赖性增加，最高达到约70%。而Lipofectamine 3000递送效率则低于15%。

腹腔巨噬细胞 (peritoneal macrophages)： 在最佳剂量下，超过80%的细胞变为tdTomato阳性。

脾脏CD4⁺ T细胞： 最高可达90%的细胞实现tdTomato阳性。

造血干细胞 (hematopoietic stem cells, LSK)： 约20%的细胞变为tdTomato阳性。

在所有细胞类型和条件下，ELP相关的细胞毒性都非常低。

功能性蛋白质递送： ENTER不仅能递送酶，还能递送转录因子。研究者使用V4-ELP-EEP13将M1巨噬细胞的关键转录因子IRF5蛋白递送至小鼠腹腔巨噬细胞。共处理后，IRF5调控的关键促炎细胞因子基因（如Ifng, Il12b, Illb）表达显著上调，而单独使用ELP或IRF5蛋白则效果有限，这证明ENTER介导的胞内递送能实现功能性蛋白的作用。

基因编辑工具递送：

基因编辑（如CRISPR）在治疗遗传病方面潜力巨大，但将大型的核糖核蛋白复合物（RNP）递送进细胞是挑战。

Cas9 RNP： V4-ELP-EEP13能有效递送SpCas9 RNP（包含化学修饰的靶向HPRT1基因的sgRNA），在HEK293细胞中实现了约65%的基因编辑效率，与商品化LNP系统CRISPRMAX相当。

碱基编辑器 RNP： V4-ELP-EEP13与ABE8e碱基编辑器RNP（靶向HEK3基因的sgRNA）共孵育后，在HEK293细胞中实现了在靶位点两个碱基上的高效A>G转换，效率达到83%，在所测试的剂量下超过了CRISPRMAX。

这些结果强有力地表明，ENTER系统可以有效地将蛋白质形式的基因编辑工具递送进多种细胞类型，实现基因编辑功能。

核酸递送：让基因沉默和mRNA疗法成为可能

除了蛋白质和RNPs，ENTER能否递送核酸呢？研究人员假设V4-ELP的阳离子C端EEP不仅能促进内涵体逃逸，还能通过静电和物理作用包裹带负电荷的核酸（siRNA、mRNA、pDNA）。

siRNA递送： V4-ELP-EEP13和其二聚体（V4-ELP-(EEP13)2）都能有效包裹siRNA（凝胶电泳和RiboGreen实验显示，在ELP蛋白与siRNA摩尔比高于10时接近100%包裹率）。包裹siRNA的纳米粒直径略有增加（约10-20纳米），zeta电位仍为正值，说明大部分siRNA被屏蔽在内部。这些纳米粒能保护siRNA不被RNase降解。功能性实验中，V4-ELP-EEP13能将siRNA递送进表达绿色荧光蛋白（GFP）的HeLa细胞，实现约75%的GFP基因沉默（gene knockdown），与其二聚体相比在较高剂量下更有效。同时，它也能将靶向Gapdh基因的siRNA递送进小鼠肺成纤维细胞，实现约95%的mRNA表达下调，与RNAiMAX效果相当。细胞内吞路径研究表明，ENTER纳米粒的内吞主要依赖于网格蛋白介导的内吞作用（clathrin-mediated endocytosis）和动力蛋白相关通路（dynamin-dependent pathways）。溶酶体示踪染料LysoTracker的荧光随时间减弱，提示纳米粒进入细胞后确实导致了内涵体/溶酶体膜的渗透性增加或破裂。

mRNA和pDNA递送： mRNA疗法（如新冠疫苗）和基因疗法（pDNA）潜力巨大。V4-ELP-EEP13同样能有效包裹mRNA（包裹效率在ELP:mRNA摩尔比高于150时接近100%）。在HEK293-RFP细胞中递送Cre mRNA时，V4-ELP-EEP13实现了最高86%的RFP阳性率，与商品化mRNA转染试剂MessengerMAX效果相当。递送Cre pDNA的效果也与脂质体Lipofectamine相当。有趣的是，研究者发现不同EEP在蛋白质和mRNA递送效率上表现出高度相关性（相关系数R=0.9062），这进一步支持了ENTER通过共同的内涵体逃逸机制介导不同大分子货物递送的观点。ENTER也能有效递送Cas9 mRNA或pDNA，实现基因编辑（mRNA编辑效率26%，pDNA编辑效率29%）。在原代细胞中，V4-ELP-EEP13也能有效递送Cre mRNA，使肺成纤维细胞和巨噬细胞分别达到54%和56%的tdTomato阳性率，且毒性很低。

体内显身手：肺部递送的振奋人心

前期的体外实验已经非常亮眼，那么ENTER在活体动物中表现如何呢？研究团队选择了一个重要的应用场景——肺部基因编辑，并以将Cre重组酶递送至小鼠肺上皮细胞为概念验证。他们通过鼻内滴注的方式给Ai9报告小鼠递送了V4-ELP-EEP13与Cre蛋白的混合物，或单独的Cre蛋白。

结果令人振奋：与单独使用Cre蛋白的对照组相比，接受ENTER共处理的小鼠肺部，无论是在大呼吸道（tdTomato阳性率达到25.4% ± 3.7% vs 对照组约5%）还是小呼吸道（tdTomato阳性率达到9.2% ± 0.9% vs 对照组约1%），上皮细胞的tdTomato阳性率（基因编辑效率）都显著提高。这表明ENTER能有效将Cre蛋白递送至肺部上皮细胞，实现基因编辑。值得注意的是，他们观察到多种重要的肺上皮细胞亚型都被成功编辑了，包括纤毛上皮细胞、分泌粘液的杯状细胞、Club细胞和基底细胞。同时，肺组织病理学评估显示，接受ENTER处理的小鼠肺部炎症反应非常轻微，安全性良好。与同样在活体小鼠肺部进行Cre蛋白递送测试的SM-102 LNP相比，ENTER显示出更优的递送效率。

ENTER的未来：通用型递送平台的曙光？

这项研究展示的ENTER系统是一个非病毒、基于蛋白质的纳米粒平台，在递送siRNA、mRNA、pDNA、蛋白质和RNPs等多种生物大分子方面都展现出了高效的胞内递送能力。与LNPs等需要针对不同货物反复优化脂质配方和化学修饰不同，ENTER的优势在于其通用性 (versatility)——无需针对不同货物进行特殊改造。

此外，ENTER的许多特性都具有重要意义：

可大规模生产和低免疫原性： ELPs可以通过大肠杆菌（E. coli）重组表达，生产成本相对较低且易于放大。ELPs本身已被证明具有较低的免疫原性和良好的可重复给药性。通过相分离和层析等方法纯化并去除内毒素，可以确保递送系统的安全性。

降低毒性： 将高效的EEP隐藏在纳米粒核心，避免了其暴露在细胞膜表面造成的非特异性损伤，显著降低了细胞毒性，使得研究团队能够发现比传统S10肽段更高效的EEP13。

触发释放机制： 基于组氨酸的pH响应性设计，确保了纳米粒及其内部的EEP和货物只有在酸性的内涵体环境中才解体暴露，实现了“按需释放”，这对于提高递送效率和降低脱靶毒性至关重要。

当然，ENTER系统目前仍有一些需要进一步研究和优化的方面。比如，如何实现高效的全身给药（systemic administration）？如何在血液循环中保持纳米粒的稳定性、避免非特异性吸附并实现对特定器官或细胞类型的靶向递送？如何进一步提高对核酸（尤其是pDNA）的递送效率？这些问题都需要未来的深入探索。

尽管如此，ENTER作为一种基于弹性蛋白的自组装纳米粒，凭借其通用性、高效的内涵体逃逸能力、低毒性、可大规模生产等潜力，为蛋白质和核酸药物的胞内递送开辟了一条充满希望的新途径。这项研究不仅发现了高效的内涵体逃逸肽EEP13，更为开发下一代通用型、智能化的药物递送平台奠定了坚实基础。也许在不远的将来，ENTER就能载着各种“细胞快递”，帮助我们更精准、更有效地治疗疾病。