Science：利用RNA-SPLIT技术揭示Xist RNA的动态变化

2021年6月24日讯/生物谷BIOON/---哺乳动物中的X染色体失活（XCI）使得XX雌性相对于XY雄性的X连锁基因表达水平相等。XCI过程由非编码RNA Xist（X 染色体失活特异性转录物）控制，它在需要失活的X染色体中表达，在那里顺式积累并招募基于染色质的基因沉默所需的因子。顺式限制在单个染色体区域的分子基础尚不清楚，但人们认为这涉及特定的Xist RNA结合蛋白（例如CIZ1和SPEN）与核蛋白支架之间的相互作用。

为了更好地了解Xist RNA的独特和不寻常的行为，来自英国牛津大学的研究人员在一项新的研究中，开发出RNA-SPLIT（sequential pulse localization imaging over time, 时间序列脉冲定位成像）：一种在经历XCI的细胞中对单个Xist分子进行时间分辨成像的方法。他们利用BglG/Bgl茎环系统来标记特定的RNA和一种BglG-HaloTag融合蛋白。在活细胞（用多西环素诱导的Xist RNA进行改造的小鼠XX胚胎干细胞）中用不同的荧光HaloTag配体连续脉冲，使得他们能够使用超分辨率三维结构照明显微镜（3D-SIM）对单一Xist RNA分子进行时间分辨率成像。相关研究结果近期发表在Science期刊上，论文标题为“Time-resolved structured illumination microscopy reveals key principles of Xist RNA spreading”。

与以前的工作一致，这些作者观察到每个细胞中由大约50到100个Xist分子组成的区域（下称Xist区域）。他们确定了诱导后1.5至5小时的时间窗口，在此期间，他们可以定量确定Xist分子在Xist区域内的逐渐增加，被称为扩展阶段（expansion phase）。一个较晚的时间点（诱导后24小时）被作为稳态下Xist RNA行为的代表。RNA-SPLIT的应用使他们能够测量这两种阶段中Xist RNA动态的关键参数。在扩张期和稳定期，Xist分子分别大约每2或4小时周转一次。通过多西环素冲刷抑制Xist转录，导致Xist RNA稳定性明显增加，这表明存在一种反馈机制来平衡转录和周转率。他们观察到在扩展阶段Xist RNA区域的径向逐渐扩大，估计速度为每小时8立方微米。径向扩大在稳定状态下并不明显，这表明一旦建立了X染色体失活，Xist RNA分子就会以一种更随机的方式定位。RNA-SPLIT进一步显示，新合成的Xist分子主要定位于存在事先合成的Xist分子的位点---他们称之为耦合（coupling）。

RNA-SPLIT可以对Xist RNA定位和相关RNA结合蛋白的作用进行功能分析，图片来自Science, 2021, doi:10.1126/science.abe7500。

这些作者扩展了他们的分析，以探究剔除CIZ1和SPEN的影响，这两个因子与Xist RNA的定位和顺式限制有关系。CIZ1的功能丧失导致Xist RNA在分化的细胞中广泛地散布于细胞核，这会增加Xist RNA的转录水平和稳定性。尽管Xist RNA广泛散布于细胞核，但之前合成和新合成的Xist分子的耦合仍然保留。SPEN的功能丧失导致了Xist RNA长距离定位存在重大缺陷，降低了Xist RNA的稳定性，并破坏了Xist RNA的耦合。SPEN在Xist RNA行为中的功能与它在XCI中基于染色质的基因沉默中的功能在遗传上是可分离的。

综上所述，RNA-SPLIT的开发使得XCI建立过程中单个Xist分子的空间定量分析成为可能。这种方法的应用揭示了Xist RNA行为（包括对Xist周转和转录的反馈控制、Xist RNA扩散的动力学以及之前合成和新合成的Xist分子的耦合）的基本原则。除了这些见解之外，RNA-SPLIT还促进了人们对CIZ1和SPEN因子如何影响Xist RNA行为和定位的不同方面的理解。（生物谷 Bioon.com）

参考资料：

Lisa Rodermund et al. Time-resolved structured illumination microscopy reveals key principles of Xist RNA spreading. Science, 2021, doi:10.1126/science.abe7500.