武汉科技大学姚凯团队开发新型CRISPR工具，逆转遗传性失明

我们人类主要通过视觉、听觉、嗅觉、触觉和味觉5种感官接受外部信息，而其中至少有80%以上的外界信息是通过视觉获取。因此，失去视觉对人来说是一件十分糟糕和可怕的事情，它不仅给失明者带来诸多生活上的不便，还会沉重打击失明者的精神信念。

长期以来，治疗失明极其困难，临床上一直缺乏治疗失明的有效方法。许多先天性失明和进行性失明与基因突变相关，近年来随着基因治疗技术的成熟，越来越多的研究尝试通过基因疗法来治疗失明。例如，张锋团队曾使用CRISPR-Cas9基因编技术恢复患有先天性黑蒙症的小鼠的视力，并将其推进到人类临床试验。这种疾病影响的是视网膜色素上皮细胞，这是一种非神经元细胞。然而，大多数遗传性失明，包括视网膜色素变性，是由于神经感光细胞本身的遗传缺陷所引起的。

视网膜色素变性（Retinitis Pigmentosa，RP），是一种进行性、遗传性、营养不良性退行性病变，主要表现为慢性进行性视野缺失，夜盲，色素性视网膜病变和视网膜电图异常，从而导致视力下降甚至失明，这也是人类失明的主要原因之一。

2023年3月17日，武汉科技大学姚凯教授团队在 Journal of Experimental Medicine 期刊发表了题为：Vision rescue via unconstrained in vivo prime editing in degenerating neural retinas 的研究论文。

研究团队将先导编辑（Prime Editor）与无PAM序列限制的spCas9突变体SpRY相结合，构建了一种新的、通用型CRISPR系统——PESpRY。PESpRY可以被编程来纠正许多不同类型的基因突变，而不管这些突变发生在基因组中的哪个位置。

研究团队使用双AAV载体递送的PESpRY系统治疗PDE6B基因突变的视网膜色素变性（RP）小鼠模型，成功恢复了功能性PDE6B蛋白的产生，挽救了神经感光细胞。进一步行为测试显示，治疗后的小鼠的视觉能力恢复良好。

这项研究为在退化的视网膜中进行无PAM序列限制的先导编辑来预防视网膜色素变性（RP）相关基因突变引起的视力丧失提供了令人信服的证据。

视网膜色素变性（RP）可由超过100种不同基因的突变引起，据估计，每4000人中就有一人患病。该疾病也入选了我国于2018年发布的《第一批罕见病名录》。视网膜色素变性开始于微弱的光敏杆状细胞的功能障碍和死亡，然后扩散到色觉所需的锥状细胞，最终导致严重的、不可逆的视力丧失。

此前已有研究表明，碱基编辑（Base Editor，BE）能够修正先天性黑蒙症小鼠模型的视网膜色素上皮细胞中的无义点突变，但碱基编辑（BE）只能对单个碱基突变进行针对性修正，对于视网膜色素变性（RP）这种可由多个不同基因的突变引起的疾病，治疗潜力显然不够。

2019年10月，刘如谦（David Liu）教授开发了一种全新的精准基因编辑工具——先导编辑（Prime Editor，PE），无需依赖DNA模板便可有效实现所有12种单碱基的自由转换，而且还能有效实现多碱基的精准插入与删除。先导编辑（PE）能够克服碱基编辑（BE）的局限性，为体内基因编辑治疗提供了新的解决方案。

2023年2月，四川大学华西医院魏于全院士、杨阳研究员、陆方教授等在 Signal Transduction and Targeted Therapy 期刊发表论文【2】。

该研究以断裂蛋白质内含子（split intein）和双AAV载体为基础，对先导编辑（PE）进行优化，并对先天性黑蒙症小鼠模型进行治疗，精确且高效（最高编辑效率达16%）修复了小鼠视网膜细胞的致病基因突变，恢复了RPE65蛋白的表达，挽救了视网膜和视觉功能，且没有检测到脱靶编辑。这项研究为通过先导编辑治疗遗传性视网膜疾病（IRD）奠定了基础。

但上述所有应用都是针对视网膜色素上皮细胞，而视网膜色素变性（RP）主要是由视网膜神经感光细胞相关基因突变引起的。基因组编辑工具在退化的视网膜神经细胞中挽救视力的直接效用仍然有限。

此外，在遗传性视网膜疾病的治疗中，特定基因突变位点附近不一定具有基因编辑工具酶（Cas蛋白）所需的PAM序列，这可能限制了基因编辑治疗时的可靶向范围。

2020年3月，哈佛医学院的研究人员在 Science 期刊发表论文【3】，开发了一种近乎无PAM序列要求的spCas9新突变体——SpRY，这为体内精准基因编辑治疗带来了新的工具。

在这项最新研究中，在这项最新研究中，姚凯团队尝试挽救患有视网膜色素变性的小鼠的视力，这些视网膜色素变性的小鼠是由编码关键酶PDE6β的基因的点突变引起。姚凯团队将先导编辑（PE）与无PAM序列限制的spCas9突变体SpRY相结合，构建了一种新的、通用型CRISPR系统——PESpRY。PESpRY可以被编程来纠正许多不同类型的基因突变，而不管这些突变发生在基因组中的哪个位置。

当编程靶向突变PDE6β基因时，PESpRY系统能够有效地纠正突变并恢复小鼠视网膜中的PDE6β酶活性，从而防止了杆状细胞和锥状细胞的死亡，并恢复了它们对光的正常电反应。

在四个月大时，携带PDE6β基因突变的小鼠（左）的视网膜变薄，缺乏杆状感光细胞（红色）。但是通过PESpRY系统纠正这种突变的小鼠（右）有更厚的视网膜，含有大量的杆状细胞

接下来，研究团队对基因编辑治疗后的小鼠进行了各种行为测试，以确认治疗的小鼠即使到了老年仍能保持视力。例如，这些治疗后的小鼠能够在视觉引导的水迷宫中找到出路，几乎和正常健康的老鼠一样，并且在视觉刺激下表现出典型的头部运动。

姚凯教授

姚凯教授表示，编辑神经视网膜细胞（尤其是不健康或即将死亡的感光细胞）基因组的能力，将为这些基因组编辑工具在治疗视网膜色素变性等疾病方面的潜在应用提供更有说服力的证据。

他还表示，将PESpRY系统推进到人类治疗，还需要进行进一步的安全性和有效性验证，但这项研究为Prime Editing这种新型基因编辑技术在体内基因治疗的潜力提供了实质性证据，特别是用于治疗视网膜色素变性等遗传性视网膜疾病。