研究人员开发聚焦离子束（FIB）减薄样品过程中三维实时定位方法

清华大学生命科学学院李雪明课题组在《Journal of Structural Biology》期刊发表了题为“Locating cellular contents during cryoFIB milling using cellular secondary-electron imaging”的研究论文。该论文利用细胞二次电子成像（CESI）技术，解决了聚焦离子束(FIB)切割样品中的定位问题（图1）。该技术基于双束电镜中扫描电镜基本的成像方式，无需额外的设备，样品也无需经过任何处理即可实现。该工作讨论了CSEI技术的成像原理，优化了CSEI的成像设置，使其可在主流的双束电镜上应用，并且经过测试，该方法在不同的切割条件下都是可信赖的。

图1：CESI技术的工作流程

冷冻电子断层成像技术（cryoET）是一项受到广泛关注地可以直接在组织或者细胞原位研究生物大分子结构的技术。FIB因能够提供近乎无损的样品减薄方式而成为了cryoET最常用的样品制备方法。然而，如何在FIB减薄样品的过程中定位目标区域一直是一个难题。

研究团队针对FIB减薄样品过程中的定位问题，想要开发一种容易操作、普适性的方法。受到层扫技术的启发，研究团队想到利用扫描电镜所成的高衬度的图像进行定位。在冷冻状态下，扫描电镜主要利用二次电子进行成像，在默认状态下，二次电子像被用来观察样品的形貌（图2a），辅助切割。而对于FIB切割出来的平面，二次电子像只能看到模糊的细菌轮廓（图2b）。为此，该工作对于二次电子像的成像原理进行探究，并对影响二次电子像成像的因素进行了一一测试，包括电压加速、电流、探测器、成像模式、驻留时间、工作距离、扫描次数等。最终，总结出了在市面上主流FIB中都适用的参数，使得不同仪器上的二次电子像都能有很好的衬度（图3）。

图2：默认状态下利用扫描电镜观察样品形貌（左）与FIB减薄后的平面（右）

图3：大肠杆菌细胞使用不同FIB设备成细胞二次电子像均能有很好的衬度

为了验证利用CESI技术进行定位的可行性，该工作将CESI技术应用到不同类型的样品上，包括细菌、单细胞真核生物衣藻、人皮肤鳞癌细胞、海拉细胞、和动、植物组织（图4），发现均能有很好的成像效果。同时，研究团队发现，在不同切割的条件下，包括在样品表面有冰渣的情况下以及大束流的切割条件下，不会影响CSEI技术的使用。

图4：不同类型的样品在CSEI技术下的成像效果

最后，该研究以衣藻的基体（basal body）为定位对象，建立了简单的切割-定位流程。使用CSEI技术定位时，从样品单侧进行减薄，每次FIB减薄后，都使用CSEI技术进行定位。CSEI技术可以实现在切割过程中进行持续实时成像和精确三维定位。

清华大学生命科学学院李雪明副教授为本文通讯作者。清华大学生命科学学院2018级博士生林超（已毕业）、生命学院博士后张立、生命学院2021级博士生张子颖、蔡司显微镜北京客户中心工程师蒋艺丰为该论文的共同第一作者。清华大学博士研究生王思涵（已毕业），清华大学周珩博士、赵雅娴博士，潘俊敏教授实验室博士研究生王正茂，李丕龙副教授实验室李如博士为本工作提供了细胞样品；李晓敏博士和李英博士为样品制备和数据收集提供的大力支持。本工作得到了国家自然科学基金、清华-北大生命科学联合中心、北京生物结构前沿中心和结构生物学高精尖创新中心的资助。