Nat Commun：突破！东京大学利用干细胞和类器官技术重现胆管发育，开启胆汁淤积性疾病治疗新纪元

胆管（bile ducts，BD）在肝脏门静脉周围特异性发育，负责将肝细胞分泌的胆汁输送到肠道。胆管细胞是肝内胆管（intrahepatic bile ducts，IHBD）的上皮成分，由肝母细胞分化而来。IHBD的结构功能障碍会阻止胆汁排泄并导致胆汁淤积，引发严重的肝损伤。血管与胆管（BV-BD）之间的相互作用对IHBD的发育至关重要。

近日，东京大学Hideki Taniguchi研究团队在Nat Commun发表了题为Generation of human iPSC-derived 3D bile duct within liver organoid by incorporating human iPSC-derived blood vessel的研究性论文。研究团队通过共培养人类诱导多能干细胞（hiPSC）生成的肝祖细胞和人工血管，成功模拟了肝上皮组织与血管间的相互作用，构建了含有人工血管的肝类器官（BVLO），重建了人类胆管结构，为研究先天性胆道疾病提供了一个有效的体外模型。

研究表明，门静脉的血管平滑肌细胞（PV-SMCs）与胆管细胞的早期分化相关。胆管细胞的分化高度依赖于门静脉（PV），PV-SMCs在胆管发育中具有重要作用。敲除Notch配体Jagged1（JAG1）会导致胆管发育异常。

本研究通过对小鼠和人类胎肝进行免疫染色分析发现，PV-SMCs在肝门区表达高水平的αSMA，而在外围区域则主要表达SM22和低水平的αSMA。外围区域的未成熟平滑肌细胞（imSMCs）与胆管细胞的早期分化相关，JAG1在这些未成熟细胞中表达较高。上述结果表明，PV-SMCs的未成熟状态与胆管发育的早期阶段密切相关。

为探讨不同成熟阶段的hiPSC-SMCs对双能肝祖细胞向胆管细胞分化的影响，研究人员从人类诱导多能干细胞（hiPSC）中诱导出血管平滑肌细胞（SMCs）。免疫荧光和定量PCR（qPCR）数据显示，在hiPSC-SMC的分化过程中，SM22+αSMAlow细胞在分化的第6天出现，而SM22+αSMAhigh细胞在第10天出现。

研究人员将第6天和第10天出现的间充质细胞分别称为hiPSC-imSMCs和hiPSC-SMCs，qPCR分析显示，JAG1在hiPSC-imSMCs中高表达，提示未成熟的SMCs（imSMCs）可能具有更高的诱导胆管细胞分化的潜力。

接着，研究人员通过建立3D共培养系统，将含有JAG1、TGFβ1和Laminin 511的人类诱导多能干细胞（hiPSC）血管与肝类器官结合，成功诱导出胆管样结构。胆管细胞在三周培养期内分化，形成了具有典型胆管标志物和结构特征的胆管样结构。该系统有效地模拟了胆管细胞的分化过程，验证了其作为研究胆管发育模型的潜力。

图1：优化的人iPSC来源血管在hiPSC血管掺入的肝类器官（BVLO）中诱导管状胆管结构

研究人员对含有血管的肝类器官（BVLO）中生成的hiPSC-胆管进行了结构和功能分析。他们发现这些胆管形成了管状结构，并具有紧密连接和微绒毛等典型的胆管上皮细胞特征。此外，这些胆管表现出了依赖多药耐药蛋白1（MDR1）的排泄和分泌功能。研究人员还检测到了γ-谷氨酰转移酶（GGT）和碱性磷酸酶（ALP）的活性，这进一步证实了hiPSC-胆管的功能性。总的来说，BVLO中的hiPSC-胆管成功再现了真实胆管的结构和功能。

当将来源于人诱导多能干细胞（hiPSC）的肝祖细胞移植到免疫缺陷小鼠的肝脏表面时，研究人员观察到移植后的胆管细胞在其顶端表面表达了OPN和乙酰化微管蛋白。这些标志物在体外培养环境中并未出现，表明这些细胞在体内环境中进一步成熟了。

为了验证移植的胆管细胞是否与宿主的胆管系统相连，研究人员向移植了胆管的小鼠肝组织中注射了碳墨水，并进行了免疫荧光分析。结果证实，移植的胆管细胞确实与宿主的肝内胆管建立了连接。这表明体内环境不仅促进了胆管细胞的高度成熟，而且还帮助它们与宿主的胆管系统形成了功能性连接。

图2：BVLO体外和体内功能表征

为进一步研究BVLO移植对胆汁淤积性疾病的作用，研究人员在免疫缺陷小鼠中通过胆管结扎（BDL）诱导胆汁淤积性肝损伤，然后将BVLO移植到小鼠肝脏表面。结果显示，移植后的小鼠存活时间显著延长，胆红素水平降低，体重减轻程度减轻。分析显示，移植的胆管结构腔体变大，推测BVLO与宿主胆管的连接可能为受体肝脏提供了一个辅助的胆汁储存空间，从而暂时缓解了胆汁淤积的症状。

图3：BVLO肝表面移植后胆管结扎小鼠模型的存活率暂时提高

最后，通过单细胞RNA测序分析BVLO（胆管和血管类肝脏类器官）中的细胞组分，研究人员发现TGFβ和Notch信号通路在胆管和血管的相互作用中发挥关键作用。

结果显示，BVLO中的细胞与人类成人肝脏细胞相似，特别是在肝细胞和胆管细胞的亚群划分上，说明TGFβ信号在内皮细胞-胆管细胞和间充质细胞-胆管细胞的相互作用中最为显著，而JAG1-NOTCH信号则主要在间充质细胞-胆管细胞的相互作用中激活。

图4：BVLO中的PV-BD相互作用

总体而言，本研究通过模拟胎儿肝脏发育中的门静脉-胆管相互作用，在hiPSC肝脏类器官中成功生成了胆管结构。研究表明，未成熟的平滑肌细胞（SMCs）在胆管发育的初期发挥了关键作用，而人工血管的引入有助于胆管腔的形成。移植后的胆管结构显示出成熟的表型标志，但仍需进一步优化以实现完全成熟。该方法有效模拟了胆管发育异常，为研究先天性胆道疾病提供了一个有效的体外模型。（生物谷Bioon.com）

参考文献：

Carolina, E., Kuse, Y., Okumura, A. et al. Generation of human iPSC-derived 3D bile duct within liver organoid by incorporating human iPSC-derived blood vessel. Nat Commun 15, 7424 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-51487-3