Neuron｜孙疏影团队揭示核斑功能紊乱导致C9ORF72-FTD/ALS的病理机制

在这项研究中，研究人员首先将邻近标记和RNA标记技术结合，通过引入split-APEX系统，首次在活细胞中特异性标记(GGGGCC)n RNA结合蛋白。通过质谱准确鉴定(GGGGCC)n RNA原位结合蛋白，发现其结合蛋白参与RNA代谢各个过程。其中超过60%核斑组分与 (GGGGCC)n RNA潜在相互作用，提示 (GGGGCC)n RNA可能大部分定位于核斑。核斑是细胞核内负责前体信使RNA加工的无膜细胞颗粒，存储大量RNA加工相关蛋白，高度动态变化。研究人员进一步通过免疫荧光染色和RNA原位杂交，在报告基因细胞，病人iPSC来源的神经细胞中，均显示大部分 (GGGGCC)n RNA定位于核斑中，并导致核斑体积增大。核斑体积而不是数量的变化，可能是 (GGGGCC)n RNA 影响核斑组分的液液相分离特性。

体外实验显示，(GGGGCC)n RNA可以诱导核斑核心蛋白SRRM2 IDR结构域由液滴向不可溶性的蛋白聚集体转变。通过CRISPR/Cas9敲入EGFP，内源性荧光标记活细胞中的核斑，FRAP实验显示，当(GGGGCC)n RNA表达时显著抑制核斑的动态特性。这些实验显示(GGGGCC)n RNA滞留于核斑中，影响其液液相分离和动态特性。

然而，体外培养细胞中不存在DPR的聚集，不能完全模拟C9ORF72-FTD/ALS患者组织中的病理特征。研究人员通过改造AAV病毒载体并成功构建AAV-(GGGGCC)₁₈₆小鼠模型。该小鼠模型完全展现了C9ORF72-FTD/ALS患者组织中的病理特征，如细胞核中聚集的 (GGGGCC)n RNA和细胞质中聚集的poly-GA, poly-GP和poly-GR。在该小鼠模型中，(GGGGCC)n RNA也主要定位于核斑中，意想不到的是部分细胞中核斑核心蛋白SRRM2错误定位到细胞质中形成聚集体。进一步发现错误定位的SRRM2主要与poly-GR共定位，少部分poly-GA和poly-GP聚体中存在SRRM2主要是由于这些聚集体中也存在poly-GR。在C9ORF72-FTD/ALS患者脑组织中也发现SRRM2错误定位，并且大部分与poly-GR共定位。而且核斑另一核心组分SON在C9ORF72-FTD/ALS患者组织中显著下调，表明在C9ORF72-FTD/ALS中核斑完整性显著损伤。

但是，在散发性的FTD和ALS患者脑组织中并没有检测到明显的SRRM2异常定位和SON蛋白的下调，说明核斑异常是C9ORF72-FTD/ALS特有的病理机制。在iPSC来源的人神经元中敲低SRRM2和SON破坏核斑的完整性，导致广泛的RNA可变剪接改变，主要影响外显子跳跃和内含子保留事件。核斑调控的RNA剪接主要发生于携带短内含子及高GC含量的转录本中。核斑核心组分偏好结合高GC含量的转录本，可能是(GGGGCC)n RNA滞留于核斑的原因。核斑核心组分SRRM2和SON的丢失导致显著的神经细胞死亡，而过表达SRRM2可以部分挽回核斑功能紊乱导致的细胞死亡。

总的来说， 这项研究利用iPSC来源的人神经细胞、动物模型和患者脑组织样品，首次发现在C9ORF72-FTD/ALS中，(GGGGCC)n RNA和poly-GR共同导致核斑功能紊乱的病理机制。一方面(GGGGCC)n RNA滞留在核斑中，抑制核斑的液液相分离和动态特性，影响RNA的准确加工；另一方面，细胞质中poly-GR和核斑核心蛋白SRRM2共聚集，破坏核斑完整性，加剧核斑的功能紊乱。核斑功能紊乱引起广泛的RNA剪接效率下降，导致外显子跳跃和内含子保留，引起神经细胞毒性。值得一提的是，在Tau相关疾病，如AD和FTD-TAU等神经退行性疾病中也存在核斑核心蛋白SRRM2的异常定位，提示靶向核斑为基础的治疗可能在多种神经退行性疾病中发挥作用。

模式图（Credit: Neuron）