研究揭示细菌第二信使c-di-GMP调节硝酸盐同化的分子机制

近日，农业微生物资源发掘与利用全国重点实验室、生命科学技术学院陈雯莉教授课题组在Nucleic Acids Research杂志在线发表题为“Cyclic di-GMP inhibits nitrate assimilation by impairing the antitermination function of NasT in Pseudomonas putida”的研究论文。该研究揭示了细菌第二信使c-di-GMP通过其受体NasT调控恶臭假单胞菌的硝酸盐同化过程的分子机制。

环二鸟苷酸(c-di-GMP)是一种细菌中广泛存在的第二信使，它通过下游受体调节生物被膜形成、运动性和细菌毒力等多种生理功能，因此鉴定新型c-di-GMP受体并揭示受体的功能机制是解析c-di-GMP功能的关键环节。陈雯莉教授团队多年来以恶臭假单胞菌为研究材料，挖掘新型c-di-GMP受体并探究其功能。在本研究中，团队构建了恶臭假单胞菌转录因子蛋白文库并从库中筛选c-di-GMP受体。结果发现，转录因子NasT (PP_2093)能特异性结合c-di-GMP，是c-di-GMP的新受体。据文献报道，NasT的同系物是一个转录抗终止子，它通过调控亚硝酸盐还原酶NirBD的表达影响硝酸盐同化，在硝酸盐同化过程中起关键作用。团队通过生长实验和基因表达检测实验验证了恶臭假单胞菌中NasT在nirBD操纵子表达中的作用。结果表明，NasT是恶臭假单胞菌以硝酸盐为唯一氮源生长所必需的，同时也是nirBD的转录所必需的。另外，高水平c-di-GMP抑制NasT与nirBD操纵子前导RNA (NalA)的结合，进而抑制NasT的抗终止功能，导致nirBD转录水平下调。

图1 NasT特异性结合c-di-GMP

NasT由N端的REC结构域和C端的ANTAR结构域组成，为了进一步探究NasT与c-di-GMP结合的机制，团队分别纯化了NasT的REC结构域和ANTAR结构域的蛋白，并测试了它们的c-di-GMP结合能力，结果发现单独的REC结构域或ANTAR结构域都不能结合c-di-GMP，说明NasT与c-di-GMP的结合需要完整的NasT蛋白。进一步的分子对接和点突变分析表明，NasT中5个氨基酸残基参与了c-di-GMP的结合，分别是R70、Q72、D123、K127和R140。在这5个残基中，R140同时参与了结合c-di-GMP和NalA。

过量亚硝酸盐对细菌是有害的，细菌会主动排出胞内过量的亚硝酸盐。因此团队进一步分析了c-di-GMP对细菌的亚硝酸盐还原酶活性和细菌胞内/外亚硝酸盐浓度的影响。结果表明高水平c-di-GMP抑制亚硝酸盐还原酶活性，导致亚硝酸盐在细菌细胞内积累并增加外排。此外，BLAST分析表明NasT存在于几乎所有已测序的假单胞菌中，而一些细菌也具有NasT的同系物，同时有一些蛋白具有与NasT相同的REC-ANTAR结构域的组成。为了测试c-di-GMP结合能力在这些蛋白中是否保守，团队测试了这些蛋白的c-di-GMP结合能力。结果表明，只有来自恶臭假单胞菌、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌和丁香假单胞菌的NasT具有结合c-di-GMP的能力。

图2 NasT中参与结合c-di-GMP的关键氨基酸

综上所述，研究团队在恶臭假单胞菌中发现了一个新的c-di-GMP受体NasT，并发现c-di-GMP通过减弱NasT与亚硝酸盐还原酶前导RNA的相互作用抑制亚硝酸盐还原酶的表达，最终抑制细菌的硝酸盐同化。

生命科学技术学院博士生聂亮及肖玉杰副研究员为论文的共同第一作者，生命科学技术学院陈雯莉教授为论文通讯作者。生科院硕士研究生周甜甜和冯浩琦、生科院博士生聂海玲、何美娜、牟可欣以及硕士梁清源参与了该论文的部分工作，资环学院黄巧云教授为研究工作的开展提供了指导与大力帮助。同时，该研究得到了国家自然科学基金和中央高校基本科研业务费专项资金的资助。