J Nanobiotechnology：截断的M13噬菌体用于暗场下大肠杆菌的智能检测

大肠杆菌（E. coli）是最常见的肠道食源性病原体之一，其监测对食品安全和环境至关重要。开发更高效、快速的方法来检测食品和环境样品中的大肠杆菌菌株至关重要。传统的方法，如培养、酶联免疫吸附试验（ELISA）和聚合酶链反应（PCR），具有明显的局限性，比如需要较长的处理时间或专用仪器。暗场显微镜以其操作方便、速度快、环境条件不严格等优点在生物分析领域得到了广泛的应用。

之前的工作表明，细菌颗粒在暗场照明下可以很容易地可视化。然而，为了能够识别所关注的特定病原体，需要对其进行抗体分离，这需要大量的时间和金钱。值得注意的是，配备受体结合蛋白（rbp）的噬菌体靶向一系列致病菌，已成为抗体的极有希望的替代品。目前，大量的研究利用特异性噬菌体或其rbp进行细菌病原体的体外检测。该方法因其特异性和识别目标细菌的效率而受到高度重视。

作为大肠杆菌的特异性噬菌体，M13噬菌体的亲和力低至2 pM。M13噬菌体的外壳由pVIII、pIII、pVI、pVII和pIX等关键蛋白组成，它们共同构建和维持噬菌体结构，介导宿主细胞感染。pVIII是主要的外壳蛋白，线性排列在大约2700个分子中，形成噬菌体特有的细长圆柱形结构。pIII负责识别宿主细胞表面的F菌，是感染的关键介质。由于其具有靶向特异性肽、结构稳定性和高度有序的丝状衣壳结构的能力，M13已被选择作为治疗和传感应用的功能性生物材料。

利用成熟的噬菌体展示技术，M13噬菌体经常被用于构建生物探针以靶向捕获特定分子。然而，作为探针材料的生物支架，较短的M13噬菌体可能比较长的菌丝更有利。这是因为野生型M13噬菌体的长度为880纳米，直径只有6纳米，类似于一根高度灵活的绳子，当M13探针用于高浓度的检测目的时，它们往往会缠结。这种缠结会模糊结合位点并导致聚集，最终导致某些探针失去结合能力。由于M13的长度由包装基因组的长度决定，因此对M13噬菌体的环状单链基因组（cssDNA）进行操作可以改变其长度。

图片来源：https://doi.org/10.1186/s12951-024-02881-y

近日，来自扬州大学动物医学院的研究者们在J Nanobiotechnology杂志上发表了题为“Truncated M13 phage for smart detection of E. coli under dark field”的文章，本研究利用截断的M13噬菌体作为捕获探针，并结合暗场显微镜，建立了一种快速准确的大肠杆菌检测策略。

迫切需要负担得起的食源性病原体检测方法，特别是大肠杆菌。暗场显微镜虽然有效，但需要对目标细菌进行特定的分离，这可能受到生产专门抗体的高成本的阻碍。另外，天然靶向大肠杆菌的M13噬菌体，通过完善的展示和修饰技术，提供了一种成本效益高的选择。然而，其长径比大的丝状结构导致了非特异性结合和低分离效率，带来了重大挑战。因此，完善M13噬菌体方法并将其与先进的显微镜技术相结合，是提高食品安全诊断检测特异性和效率的关键途径。

基于tM13和智能暗场成像平台的大肠杆菌快速检测原理图

图片来源：https://doi.org/10.1186/s12951-024-02881-y

研究者采用双质粒策略生成截断的M13噬菌体（tM13），这个工程tM13包含两个关键的遗传修饰：pIII的n端部分突变和pVIII的疏水端生物素化。这些改变使tM13能够有效地附着在不同的大肠杆菌菌株上，促进快速磁分离。为了检测，研究者还实现了一种基于卷积神经网络（CNN）的算法，用于使用暗场显微镜对细菌细胞进行精确鉴定和定量。

从峰值和临床样品分析中获得的结果表明：基于tm13的免疫磁富集方法结合人工智能分析具有准确性、高灵敏度（检测限为10 CFU/μL）和节省时间（30分钟）的特点，从而支持其在复杂样品中促进多种大肠杆菌菌株鉴定的潜力。

截断的M13噬菌体用于暗场下大肠杆菌的智能检测

图片来源：https://doi.org/10.1186/s12951-024-02881-y

综上所述，本研究推出了一种创新的检测平台，该平台基于通过磁分离高效识别生物素化截断的M13噬菌体，以及一种专为大肠杆菌快速、精细和鉴别检测而定制的智能暗场成像系统。考虑到噬菌体的多样性和对被感染宿主的特异性，理论上基于tm13的AI方法可以推广到其他任何噬菌体物种，快速灵敏地检测其宿主细菌。(生物谷 Bioon.com）

参考文献：

Jiasheng Yuan et al. Truncated M13 phage for smart detection of E. coli under dark field. J Nanobiotechnology. 2024 Oct 3;22(1):599. doi: 10.1186/s12951-024-02881-y.