Nature Methods：当细胞开始“自白”，解码癌症基因的双面叙
来源：生物探索 2025-02-19 11:56
DEFND-seq能够同时分析同一细胞核的DNA和RNA，研究人员能直接建立基因突变-表达表型-细胞功能的因果关系，为精准医疗提供全新工具。
在肿瘤的微观宇宙中，每个癌细胞都像是携带双重身份的特工：它的DNA中潜藏着驱动恶性行为的突变密码，而RNA则实时演绎着这些指令带来的致命行动。然而，研究人员长久以来被迫以“分屏视角”观察这场阴谋——单细胞RNA测序（scRNA-seq）揭示细胞的行为特征，单细胞DNA测序（scDNA-seq）捕捉基因组的异常，但二者如同断线的密码本，难以拼凑出完整的犯罪证据链。这种割裂在胶质母细胞瘤（glioblastoma）等高度异质性肿瘤中尤为致命：为何某些携带EGFR基因扩增的细胞疯狂增殖，而另一些PDGFRA突变的细胞却伪装成神经前体细胞逃避免疫追杀？传统技术无法回答的问题，正在成为精准医疗的“黑洞”。
2月12日《Nature Methods》的一项突破性研究“Scalable co-sequencing of RNA and DNA from individual nuclei”带来了颠覆性工具——DEFND-seq（DNA和表达谱联合测序技术）。这项技术如同给细胞核安装“双通道监听器”，首次实现从同一细胞核中同步捕获全基因组DNA变异和全转录组RNA表达。其核心创新在于锂二碘水杨酸（lithium diiodosalicylate）介导的染色质解聚技术：通过温和去除核小体（nucleosome），让DNA舒展成可被转座酶（transposase）均匀切割的“开放书页”，同时保留核膜完整性以捕获完整RNA。结合10x Genomics微流控系统，单个实验即可分析数万个细胞核，每个细胞的试剂成本仅0.56美元，却可检测超过73万条DNA片段和2万个RNA分子，灵敏度与性价比远超同类技术。
在胶质母细胞瘤的实战中，DEFND-seq揭开了令人震撼的真相：携带EGFR扩增（DNA拷贝数变异）的细胞群高表达细胞周期基因TOP2A，而PDGFRA突变的亚克隆则呈现少突胶质前体细胞（OPC-like）的转录特征。更惊人的是，在看似均质的肿瘤中，某些稀有细胞竟同时拥有EGFR p.D1082N和MAP2K3 p.D24N突变，提示它们可能是耐药性的“种子选手”。这些发现不仅验证了技术可靠性，更凸显其揭示“基因突变-细胞行为-临床表型”因果链的独特价值。
更值得关注的是，DEFND-seq成功唤醒了沉睡多年的冷冻肿瘤样本。在对保存4年的胶质母细胞瘤分析中，研究人员仍捕获到MYCN基因扩增和PTEN缺失的致癌特征，这为利用海量临床库存样本开展回溯性研究打开闸门。这项技术像一台时间机器，让我们能重新聆听那些曾被冰封的细胞故事。从癌症进化图谱到发育生物学谱系追踪，DEFND-seq正为生命科学提供前所未有的“全息视角”，而它的故事，才刚刚开始书写。
为什么我们需要同时读取DNA和RNA？肿瘤的“双重伪装术”
癌症的致命之处在于其高度的异质性——同一肿瘤中，不同癌细胞可能携带不同的基因突变（DNA层面），同时表现出截然不同的行为模式（RNA层面）。例如，某些胶质母细胞瘤（glioblastoma）细胞可能因EGFR基因扩增而疯狂增殖，另一些则因PDGFRA突变获得侵袭能力。传统单细胞测序技术如scRNA-seq（单细胞RNA测序）或scDNA-seq（单细胞DNA测序）只能揭示其中一面，导致两个关键问题：
基因突变如何驱动特定细胞行为？例如，某个DNA拷贝数变异（CNV）是否直接导致下游基因表达异常？
肿瘤微环境中，癌细胞如何与正常细胞互动？这些互动是否受特定突变调控？
DEFND-seq的诞生，正是为了解开这些谜题。通过同时分析同一细胞核的DNA和RNA，研究人员能直接建立基因突变-表达表型-细胞功能的因果关系，为精准医疗提供全新工具。
DEFND-seq核心技术：如何让DNA和RNA“双剑合璧”？
DEFND-seq的全称是DNA和表达谱联合测序技术（DNA and Expression Following Nucleosome Depletion Sequencing），其核心创新在于两步关键操作：
1. 染色质解聚：打开细胞核的“折叠藏书”
细胞核中的DNA并非散乱分布，而是像紧密缠绕的线团，包裹在组蛋白（nucleosome）形成的染色质结构中。DEFND-seq使用碘化锂（lithium diiodosalicylate）处理细胞核，温和去除组蛋白，使DNA充分暴露。这种处理既保持核膜完整，又让后续的转座酶（transposase）能均匀切割DNA，避免传统方法因染色质压缩导致的数据偏差。
2. 微流控“分装术”：万级细胞的高通量捕获
解聚后的细胞核通过10x Genomics微流控芯片，与携带条形码（barcode）的磁珠共包裹在油滴中。每个油滴内，RNA被逆转录为带条形码的cDNA，DNA则被片段化并标记相同条形码。最终，通过测序可追溯每个DNA片段和RNA分子来自哪个细胞核，实现DNA突变与RNA表达的精准配对。
模式图（Credit: Nature Methods）
数据说话：DEFND-seq的四大性能突破
研究团队通过多组实验验证了DEFND-seq的可靠性，关键数据如下：
高覆盖度：捕捉更多基因“信号”
在人类BJ成纤维细胞中，DEFND-seq平均每个细胞核检测到731,814条独特DNA片段和20,000个独特RNA转录本，远超同类技术sci-L3（仅40,681条DNA片段和194个RNA）。
基因组覆盖均匀性（CV值）低至0.6（100 kb区间），媲美主流单细胞DNA测序技术（如LIANTI、PTA等）。
高准确性：区分“人类”与“小鼠”细胞的火眼金睛
在混合人类U87和小鼠3T3细胞的实验中，DEFND-seq仅产生5.2%的交叉污染，且RNA与DNA数据高度一致。例如，某个细胞若在RNA中显示90%人类基因表达，其DNA数据也会同步显示人类基因组特征，验证了技术的精准性。
冷冻样本兼容性：解锁临床珍贵样本
对保存4年以上的胶质母细胞瘤冷冻样本，DEFND-seq仍成功捕获1,821个细胞核，检测到关键致癌基因MYCN扩增和PTEN缺失。这意味着该技术可回溯分析大量临床库存样本，极大拓展研究资源。
成本可控：单个细胞分析仅需0.56美元
利用10x Genomics商业化平台，单次实验可处理超40,000个细胞核，每个细胞的试剂成本低至0.56美元（约合人民币4元），为大规模研究铺平道路。
实战案例：胶质母细胞瘤的“基因-表型”地图
胶质母细胞瘤（GBM）是最致命的脑癌，5年生存率不足5%。应用DEFND-seq分析患者肿瘤组织，研究者揭示了前所未有的细节：
发现“基因型-表型”强关联
EGFR扩增（DNA层面）的细胞群高表达增殖相关基因（如TOP2A），而PDGFRA扩增的细胞则呈现类似少突胶质前体细胞（OPC-like）的转录特征。
在DNA拷贝数聚类中，MDM2基因扩增普遍存在于所有癌细胞，提示其可能是驱动基因组不稳定的关键因素。
追踪稀有突变亚群
发现EGFR p.D1082N和MAP2K3 p.D24N等罕见体细胞突变，变异等位基因频率（VAF）低至5%-8%。这些突变可能介导肿瘤耐药性，成为潜在治疗靶点。
通过多平台测序（Illumina vs. Element Aviti）交叉验证，确认PREX1 p.T1469M突变在部分细胞中富集，且与星形细胞样表型相关。
技术优势：为何DEFND-seq是游戏规则改变者？
“一站式”分析平台：无需改造设备，直接兼容10x Genomics商业化系统，全球实验室可快速部署。
冷冻样本复活术：突破传统单细胞测序对新鲜样本的依赖，让历史临床数据焕发新生。
多组学扩展潜力：未来可与CRISPR筛选、谱系追踪等技术结合，解析基因调控网络。
成本效益比：相较于动辄数万美元的单细胞多组学方案，DEFND-seq将成本降低一个数量级。
未来：从实验室到临床的转化之路
DEFND-seq的应用远不止于癌症：
发育生物学：追踪胚胎早期细胞的基因突变与分化路径。
神经退行性疾病：揭示神经元DNA损伤与蛋白质异常表达的关系。
免疫治疗：筛选具有特定突变特征的T细胞克隆，优化CAR-T疗法。
这项技术就像给每个细胞核安装了“行车记录仪”，让我们能回放基因突变如何一步步改写细胞命运。
打开精准医学的“上帝视角”
DEFND-seq的诞生，标志着单细胞多组学分析迈入新时代。当研究人员能同时窥见细胞的“基因蓝图”和“行为日志”，癌症异质性、耐药机制、转移规律等难题将加速破解。或许在不远的未来，每个患者的肿瘤都将被解构为一张动态的“基因-表型地图”，指引真正个性化的治疗方案。
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