Cell Stem Cell | 革新疗法：CRISPR-Cas9基因编辑技术在遗传性肝病治疗中的应用

细胞疗法在治疗许多顽固性疾病方面具有巨大的潜力，包括骨、角膜、皮肤和软骨的多种市场授权方法。尽管该领域进展迅速，但向更复杂的实体器官(如肝脏)转移存在巨大障碍。由于其再生能力，移植的肝细胞可以通过重新填充来替代肝脏中患病或受伤的肝细胞来修复组织。因此，肝细胞移植是治疗遗传性肝病的一种很有前途的方法，并已显示出积极的临床结果。然而，同种异体肝细胞移植的持久疗效在临床上受到同种异体细胞移植物的免疫排斥，甚至免疫抑制的限制。体外自体细胞疗法在避免免疫反应和提高长期疗效方面具有相当大的优势，因此具有治愈严重遗传疾病的潜力。

近年来，在诱导多能干细胞(iPSCs)分化或成纤维细胞直接转分化制备自体肝细胞样细胞(HLCs)方面取得了显著进展。然而，高期望的肝细胞在移植后缺乏有效的再生能力和成熟的肝脏功能。因为在大多数肝脏疾病中，大约10%的肝细胞被替换以显示治疗效果，开发自体肝细胞源需要具有与临床移植相适应的高再生能力。鉴于分离的原代患者肝细胞的稀缺性，体外培养的患者肝细胞可以成为自体肝细胞治疗的重要细胞来源。原代肝细胞中的基因敲入仍然是低效的，主要是由于其增殖能力较低，阻碍了患者自体肝细胞的功能校正和应用。为了克服这一限制，培养具有强大增殖能力的肝细胞可能提供实现高度遗传整合的可能性。一个迫切的临床需求是开发一种方法来产生具有肝脏再生能力的自体基因校正的增殖肝细胞。

模式图（Credit: Cell Stem Cell）

基因编辑技术的进步使转基因在人类原代细胞中的精确整合成为可能，扩大了实验和临床细胞治疗的范围。通过CRISPR-Cas9靶向CAR-T细胞治疗淋巴瘤已被证明具有很高的安全性和有效性。然而，确定一种有效的方法靶向大的DNA cargo到肝细胞仍然是难以捉摸的。使用同源定向修复(HDR)模板编辑肝细胞的尝试导致低靶向性(<1%)和高毒性扩大患者源性肝细胞、优化靶向策略和使用腺相关病毒(AAV)的模板递送可能解决这些问题。因此，系统探索这些关键条件可能实现有效的靶向整合，促进自体肝细胞治疗的发展。

该研究开发了一种培养系统，用于大规模扩增患者来源的原代人肝细胞(PHHs)，为基因敲入提供了一种具有巨大潜力的自体肝细胞来源。经过系统优化，发现AAV2.7m8有效地使Cas9介导的靶向整合能够纠正增殖的人肝细胞(ProliHHs)中的患者缺陷基因。此外，基因编辑的ProliHHs可以有效地重新填充、成熟并成功治疗小鼠酪氨酸血症。该研究为体外自体可扩展基因编辑肝细胞治疗人类遗传性肝病提供了概念证明。