Cell：李晓淳团队揭示Wnt生物发生和分泌以及Wnt7特异性信号的分子基础

德克萨斯大学西南医学中心李晓淳实验室在 Cell 期刊发表了题为：Molecular basis of Wnt biogenesis, secretion and Wnt7 specific signaling 的研究论文【2】。

该研究以Wnt7a的合成、分泌和激活入手，阐释了脂修饰的Wnt蛋白是如何在ER中完成由PORCN向WLS的转移，WLS如何在细胞表面释放Wnt，以及中枢神经中Wnt7 特异性共受体RECK是如何发挥功能的。

为了鉴定ER中参与Wnt蛋白合成的因子， 研究团队在HEK293细胞中共表达了Wnt7a-WLS-RECK复合物。电镜结构显示出一个未知内源性蛋白结合Wnt7a，质谱鉴定和AlphaFold结构预测指出该蛋白为钙网蛋白（calreticulin，CALR）。CALR的Lectin 结构域主要作用于Wnt7a 的第295位天冬酰胺糖基化修饰，此修饰位点在大部分Wnt中保守。当在Wnt7a或Wnt3a中突变掉该糖基化位点时，突变体丧失了与CALR的结合能力，同时分泌量减少，激活下游信号能力显著减弱。

为了探究Wnt蛋白在被PORCN脂化时是否有CALR参与，研究团队共表达了PORCN和Wnt蛋白，CoIP实验显示，在Wnt蛋白存在的情况下，过表达的PORCN，内源WLS，内源CALR能够和Wnt蛋白形成四元复合物，加上对结构的分析，研究团队得出CALR通过稳定Wnt蛋白来帮助其从PORCN到WLS转运的结论。研究团队对其他18种Wnt蛋白进行氨基酸序列比对和CoIP实验，结果显示除了Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a和Wnt9b，CALR参与其他15种Wnt的合成，揭示了CALR对于Wnt蛋白的折叠，转运和合成中具有重要作用。

为了进一步探究Wnt蛋白是如何从WLS上释放的，研究团队又解析了单独的WLS结构。与Wnt7a-WLS复合物结构对比发现，复合物的WLS跨膜区间结合了一个磷脂分子，该结果与已经报道的Wnt8a-WLS结构（Cell 184:194）和Wnt3a-WLS结构（Nature Communications 12: 4541）类似。但是单独的WLS并没有结合磷脂分子，而且其跨膜区发生了显著的构像变化，使结合Wnt蛋白hairpin2和脂修饰的口袋闭合。另外，虽然磷脂分子没有直接参与和Wnt7a的互作，但是CoIP实验和分子动力学实验证明磷脂分子对于WLS结合Wnt7a非常重要，因此该研究首次提出由磷脂分子介导的Wnt从WLS释放模型。有趣的是，通过分析单独的WLS结构，他们发现WLS跨膜区存在一个空腔，可以作为其抑制剂的结合位点，抑制Wnt的分泌，为靶向WLS的药物设计提供了重要依据。

此外，通过对Wnt7a-RECKCC4复合物结构的分析，作者发现作为Wnt7a的特异受体， RECK的CC4结构域结合在Wnt7a的N端结构域。参与RECK互作的氨基酸在其他17种Wnt蛋白里面是不保守的，突变二者相互作用的氨基酸会减弱Wnt7a介导的信号活性，从而揭示了RECK实现对Wnt7特异性的机理。

Wnt合成分泌以及Wnt7a信号通路示意图

总而言之，这项工作通过结构生物学，生物化学和细胞生物学的方法鉴定了第一个Wnt合成中的伴侣蛋白，提出了Wnt合成和分泌的新模型，并且阐释了Wnt7共受体的作用。该研究为抗癌药物研发，中枢神经中血脑屏障修复提供了分子模型。