Cell Metab | 王晓东/郑三多合作揭示ZnT1作为新型铜离子转运蛋白介导铜离子吸收导致铜死亡的分子机制

在之前铜死亡的研究中，铜离子主要是通过小分子载体携带进入细胞内部。本研究中，研究人员通过使用高浓度CuSO₄直接处理HeLa细胞，诱发铜死亡。在此基础上，研究人员通过CRISPR-Cas9全基因组功能缺失筛选，鉴定到锌离子转运蛋白ZnT1是铜死亡发生的必需基因。对ZnT1敲除的HeLa细胞进行CuSO₄处理不能引发铜死亡，而回补表达ZnT1则可以重建铜死亡。通过ICP-MS质谱鉴定细胞内元素含量发现，相比于野生型HeLa细胞，ZnT1敲除细胞内Cu元素水平显著降低。进一步在体外脂质体实验中发现，Cu²⁺可以进入整合有ZnT1蛋白的脂质体内部，淬灭Calcein荧光分子，而不能进入不整合ZnT1蛋白的脂质体。这些实验证明了ZnT1具有直接转运Cu²⁺的功能。

在后续的研究中，研究人员通过冷冻电镜结构解析与功能实验验证，揭示了Zn²⁺和Cu²⁺在ZnT1中共享主要的结合位点。Zn²⁺会竞争Cu²⁺与ZnT1的结合，从而有效抑制Cu²⁺转运和铜死亡。这项结果提示，临床上通过补充锌离子治疗威尔逊氏疾病，很可能是由于Zn²⁺抑制了ZnT1转运Cu²⁺来抑制铜吸收，从而缓解威尔逊氏疾病的症状。 

通过结构的比对分析，研究人员还发现，相比于其他锌离子转运蛋白家族（ZnT family）的成员，ZnT1更倾向于形成一种外向型构象（Outward-facing conformation）。这主要是由于在ZnT1二聚体中，一个单体跨膜结构域的螺旋2与另一单体跨膜结构域的螺旋3通过丝氨酸残基与谷氨酸残基形成氢键，进而稳定了外向型构象。此外ZnT1在胞外区以一种特有的亚基间二硫键，加固了这种外向型构象，更有利于铜离子的捕获和吸收。在细胞实验中，向ZnT1敲除细胞系回补上述残基的ZnT1突变体，相比于回补野生型ZnT1，均在一定程度上抑制了铜死亡，证明了ZnT1的外向型构象对于铜离子转运的功能是至关重要的。

动物实验证明，肠上皮细胞中ZnT1蛋白缺失会导致小鼠锌离子吸收缺陷，从而导致小鼠死亡，但这种表型在补充锌离子后则不会发生。同时，ZnT1缺失抑制了肠上皮从血液中吸收铜，最终导致肠上皮铜含量降低，血清中铜含量升高。此外，研究人员还发现， ZnT1转运铜离子的功能对于维持Lgr5阳性肠干细胞是必需的，ZnT1的缺失会导致Lgr5阳性肠干细胞受损，而这一表型不能被外源锌离子的补充所拯救。

综上所述，本研究首次发现了锌离子转运蛋白ZnT1介导铜离子转运并参与铜死亡调节。通过结构解析，提出锌离子竞争性抑制铜离子转运的分子机制，并进一步阐述了ZnT1采取一种外向型构象（Outward-facing conformation）保证了铜离子的捕获与吸收。这为临床上通过锌离子治疗威尔逊氏疾病提供了有力的理论依据。在生物体内，ZnT1转运铜离子的功能，对于肠道干细胞的维持具有重要意义。