Nature Methods | 解码基因调控新机制：系统性发现人类转录组中的RNA结构开关

基因表达的调控在所有生命王国中都是至关重要的过程。自从发现核糖体（ribosome）和RNA聚合酶（RNA polymerase）等分子机器以来，研究人员逐渐认识到RNA在基因调控中的核心作用。特别是一些古老的RNA调控机制，如核酶（ribozymes）和RNA结构开关，展示了RNA分子在细胞内复杂的功能。

在细菌中，核糖开关（riboswitches）通过结合小分子配体（ligands），诱导RNA构象变化，从而控制基因表达。例如，核糖开关可以感知环境中的代谢物浓度，并通过改变其二级结构（secondary structure）调控相关基因的转录或翻译。然而，在真核生物中，尽管植物和真菌中已鉴定出一些硫胺素焦磷酸（thiamine pyrophosphate）感应核糖开关，但在人类中已知的RNA开关仅有两个：一个是依赖于蛋白质的血管内皮生长因子A（VEGFA）RNA开关，另一个是基于m6A修饰的RNA开关。因此，RNA开关在高等真核生物基因表达中的总体影响仍不清楚。

SwitchSeeker：系统性鉴定RNA结构开关的方法

为了填补这一知识空白，研究团队开发了SwitchSeeker，一种综合计算和实验的方法，用于系统鉴定功能性RNA结构开关。SwitchSeeker结合了计算模型和高通量实验技术，通过迭代的预测和验证过程，有效地鉴定并表征RNA开关。

首先，研究团队开发了一种名为SwitchFinder的计算模型，该模型能够从头（de novo）预测RNA开关。SwitchFinder通过生成RNA序列的二级结构及其对应的能量景观（energy landscape），识别具有RNA开关特征的序列。这些特征包括两个局部能量最小值（local minima）和一个相对较小的能量屏障（energy barrier）。通过这种方式，SwitchFinder能够在不依赖已知序列模式的情况下，识别出新的RNA开关。

在验证SwitchFinder的性能时，研究团队将其应用于一组已知的RNA开关家族，并观察到该模型在这些家族中的预测准确性比现有的方法更高。接下来，他们将SwitchFinder与高通量实验技术相结合，创建了一个端到端的预测和验证平台，命名为SwitchSeeker。

SwitchFinder在识别人类基因组中的候选RNA开关时的结果（Credit: Nature Methods）

图a. SwitchFinder如何在VEGFA（血管内皮生长因子A）mRNA序列中定位RNA开关。示例显示了RNA开关在序列中的具体位置。

图b. SwitchFinder对常见Rfam家族RNA开关预测的ROC曲线。SwitchFinder应用于真实序列和乱序对照序列的混合物，ROC曲线衡量其正确选择真实序列的能力。结果表明，SwitchFinder在不同RNA开关家族中的预测表现良好。

图c. 比较了SwitchFinder和SwiSpot两种模型在Rfam家族中的RNA开关预测性能。每个点代表一个Rfam家族，结果显示SwitchFinder在大多数RNA开关家族中的预测准确性优于SwiSpot。

图d. 展示了SwitchFinder在各种天然和合成核糖开关（riboswitches）群体中的预测表现，包括细菌、真核和合成的核糖开关。结果表明，SwitchFinder在识别这些不同类型的核糖开关时表现出色。

在人类转录组中的应用

研究团队将SwitchSeeker应用于人类转录组，以鉴定潜在的RNA开关。首先，他们对人类转录组的3'非翻译区（3' UTR）进行了分析，选择了长度不超过186个核苷酸的3,750个候选开关元素。为了进一步筛选出在细胞中既功能性又结构上双稳态（bi-stable）的RNA开关，他们分别进行了两项高通量体内筛选实验：结构筛选和功能筛选。

结构筛选

在结构筛选中，研究团队利用DMS-MaPseq技术对表达候选RNA开关文库的HEK293细胞进行了分析。DMS-MaPseq数据中的单核苷酸可及性（accessibility）反映了多个RNA分子在Gibbs自由能景观中的不同能量最小值。如果一种构象占主导地位，它将在DMS-MaPseq反应性谱中表现出来；如果多种构象共存，它们将共同贡献于反应性谱。通过这种方法，SwitchSeeker能够识别出在体内共存于两种构象之间的RNA开关。

功能筛选

在功能筛选中，研究团队实施了大规模并行报告基因分析（MPRA），在HEK293细胞中功能性地探测RNA开关。他们将3,750个候选RNA开关序列或相应的乱序对照序列克隆到一个双荧光报告基因（eGFP-mCherry）中，使用eGFP荧光测量候选RNA开关对基因表达的影响，同时使用未受影响的mCherry荧光作为内源对照。通过流式细胞仪对按eGFP

表达比例分类的细胞进行排序和测序，研究团队发现536个候选RNA开关显著下调了eGFP的表达，538个候选RNA开关显著上调了eGFP的表达。

大规模并行报告基因分析（MPRA）在捕捉候选RNA开关不同构象之间功能差异时的结果（Credit: Nature Methods）

图a. 概述了SwitchSeeker平台在识别人类转录组中3'非翻译区（3'UTR）候选RNA开关的流程图。从人类转录组中选择出约3,750个候选RNA开关，通过结构筛选和功能筛选进一步筛选出1,454个候选RNA开关，并最终确认245个具有功能差异的双稳态结构开关。

图b. 展示了功能筛选的结果。每一行代表一个候选RNA开关，每一列代表通过报告基因表达（eGFP荧光，相对于mCherry荧光）定义的单个分类。在排序的八个分类中，展示了下调、中性和上调基因表达的候选RNA开关的相对丰度。

图c. 描述了大规模平行突变分析（MPRA）设置。对于每个候选RNA开关，设计了四个突变序列变体，其中两个锁定在构象1，另外两个锁定在构象2。通过这种方式，生成了一个序列库，每个候选RNA开关由四个突变序列变体和参考序列表示。

图d. 展示了通过MPRA确定的高置信度候选RNA开关的具体示例。底部展示了SwitchSeeker预测的两种备选构象，结合了RNA二级结构探测数据。顶部展示了候选RNA开关在不同构象锁定时对报告基因表达的影响。每一行代表一个锁定RNA开关在特定构象的序列变体，每一列代表基因表达定义的一个分类。

关键发现：RORC RNA开关

为了验证SwitchSeeker的预测，研究团队选择了位于RORC（RAR-related orphan receptor C）转录本3' UTR中的一个开关进行深入分析。通过DMS-MaPseq结构探测和单颗粒低温电子显微镜（cryo-EM），他们确认了该RNA开关在两种不同的分子构象中存在，并通过基因组范围的CRISPR干扰（CRISPRi）筛选发现其中一种构象通过激活非经典的无义介导mRNA降解（NMD）途径减少了RORC基因的表达。

研究团队设计了突变-恢复（mutation-rescue）实验，以确认RORC RNA开关的两种构象在基因表达中的不同作用。他们发现，一些突变可以稳定其中一种构象，而另一些突变则可以稳定另一种构象。例如，位于Box 1、Box 2和Box 3的突变对RORC RNA开关的结构和功能有显著影响。进一步的实验表明，这些突变在体外和体内都展示了类似的构象变化，验证了该RNA开关在不同环境中的稳定性。

通过SwitchSeeker的应用，研究团队最终报告了245个高置信度的功能性RNA结构开关。这一研究不仅扩展了我们对RNA开关在基因调控中的理解，还为未来全面表征不同细胞类型和生物体中的RNA开关奠定了基础。

SwitchSeeker作为一种迭代的预测和验证平台，通过结合计算模型和高通量实验技术，能够有效地鉴定并表征RNA开关。这一框架的应用不仅限于3' UTR，还可以扩展到其他类型的RNA开关研究中，为揭示真核生物RNA调控机制提供了新的视角。

该研究展示了RNA结构开关在基因表达调控中的重要性，并强调了开发新的RNA开关鉴定方法的必要性。未来，SwitchSeeker有望被应用于更广泛的转录组研究中，揭示更多关于RNA结构和功能的奥秘。