Nature Biotechnology：颠覆“反义即沉默”旧识！发现广泛存在的天然trans-RNA可激活基因翻译

越过“路障”：trans-RNA的设计哲学

在试图干预翻译起始时，我们面临的核心挑战是：如何在不改变目标mRNA原始序列的前提下，改变核糖体的行为？目前的基因激活工具，如CRISPRa系统，主要是在转录层面起作用；而像反义寡核苷酸（ASOs）虽然能通过改变RNA二级结构影响翻译，但往往依赖于特定的序列背景，且更多时候被用于基因沉默。

该研究的研究人员提出了一个大胆的设想：如果不能改变mRNA这条“铁轨”，我们能不能给核糖体搭建一座“立交桥”？

他们设计了一种带有5'帽结构（m7G cap）的外源短RNA片段，命名为 trans-RNA。这个分子的设计非常精简：它的序列与目标mRNA上游的特定区域互补，能够与之形成双链RNA（dsRNA）结构。研究人员的假设是，这个外源的“trans-cap”可以作为核糖体的一个新入口。当核糖体被trans-RNA招募后，通过某种机制“跳”到目标mRNA上，从而避开目标mRNA原本5'端的uORF等抑制元件，直接起始下游蛋白的翻译。

为了验证这一设想，研究人员构建了一个含有上游开放阅读框（uORF）的GFP荧光报告基因系统。在正常情况下，uORF的存在会强力抑制下游GFP的翻译。然而，当他们将一段长度为15个核苷酸、与uORF下游区域互补的全配对trans-RNA转染到HEK293细胞中时，奇迹发生了：GFP的蛋白水平激增了9倍以上。

这是一个令人兴奋的起点，但魔鬼往往隐藏在细节中。研究人员敏锐地发现，trans-RNA的设计至关重要。如果trans-RNA的5'端有一段未配对的延伸序列（unpaired extension），随着延伸长度的增加，GFP的翻译增强效果会逐渐减弱。这暗示了一个极其微妙的空间位置效应：trans-RNA与目标mRNA形成的双链结构，必须足够靠近核糖体扫描的路径，或者说，这种“搭桥”行为对空间构象有严格要求。

更重要的是，这种增强作用并非源于mRNA稳定性的改变。数据显示，在trans-RNA存在的情况下，目标mRNA的丰度并没有发生显著变化。这意味着，我们观察到的蛋白水平提升，实实在在是翻译效率（Translation Efficiency）层面的飞跃。

深入机理：核糖体的“空间跳跃”与协同效应

既然trans-RNA能以此种方式激活翻译，那么核糖体究竟是如何从trans-RNA“跳”到目标mRNA上的？这是一个拓扑学上的难题。通过生化实验和冷冻电镜（Cryo-EM）技术，研究人员抽丝剥茧，揭示了一个双重机制。

首先，这是一种协同效应。实验表明，即使目标mRNA本身的5'帽结构被移除，trans-RNA依然能促进翻译，这说明trans-RNA提供了一条独立的核糖体招募途径。但在保留原始帽结构的情况下，两者并不冲突。荧光解旋实验（Fluorescence duplex unwinding assay）的数据显示，在trans-RNA存在时，双链解旋信号增加了约50%，这表明核糖体在目标mRNA上的加载或扫描活动显著增强了。

这里的物理图像是：trans-RNA通过与目标mRNA配对，实际上在空间上将目标mRNA“拉”成了一个环状或特定的构象，这种分子内环化（Topological circularization）模仿了真核生物翻译起始中经典的mRNA闭环模型。

其次，为了搞清楚核糖体具体是如何落位的，研究人员进行了一项精细的“盲区测绘”实验。他们在报告基因的起始密码子（AUG）上游不同距离处设计了双链结构。结果发现，当双链结构距离AUG小于15个核苷酸时，翻译几乎完全被抑制；而当距离超过20个核苷酸时，AUG重新变得“可见”。

这个约15-20个核苷酸的区域，被研究人员称为“盲区”（Blind spot）。这恰好对应了核糖体mRNA通道（mRNA channel）的长度。这个数据的含义非常深刻：它意味着核糖体不仅仅是简单地从trans-RNA滑过去，而是通过“前向装载”（Front-loading）和“后向装载”（Back-loading）两种模式进入目标mRNA。

所谓的“后向装载”，是指核糖体可能先结合在trans-RNA的帽上，然后通过空间上的邻近性，将mRNA的下游序列直接塞入核糖体的解码中心（Decoding Center）。这一点在冷冻电镜结构中得到了佐证。研究人员解析了分辨率高达 2.8 Å 的48S起始复合物结构，惊讶地发现，即使在没有经典Kozak序列背景的情况下，trans-RNA也能引导核糖体精准定位。在结构模型中，可以看到起始密码子AUG清晰地面对着tRNA反密码子环，而AUG上游的序列并不符合Kozak共有序列，这进一步证实了trans-RNA引导的起始具有极强的特异性和独立性。

更有趣的是，电镜结构显示eIF3d亚基和eIF3八聚体在复合物中占据了特定位置，虽然没有直接观察到trans-RNA的电子密度（可能是由于其高度动态性），但结构数据强烈支持了一种非传统的mRNA“插入”模式（Slotting mechanism），这解释了为何核糖体可以绕过上游的障碍。

环状RNA的救赎：无需IRES的翻译启动

如果说在线性mRNA上的应用是对现有规则的“绕道”，那么在环状RNA（circRNA）上的应用则是一场彻底的“解放”。环状RNA因其闭环结构，天然缺乏5'帽和3'尾，具有极高的稳定性，是下一代RNA疗法的明星候选者。然而，环状RNA的翻译通常依赖于内部核糖体进入位点（IRES）。IRES序列往往很长，且具有复杂的二级结构，这在药物设计上是一个巨大的累赘，且往往受到细胞类型的限制。

trans-RNA系统为环状RNA提供了一种极其优雅的翻译启动方案。由于trans-RNA是外源提供的，它就像一个独立的“引擎”，挂载到环状RNA这个“车厢”上。

研究人员构建了编码纳米荧光素酶（nLuc）的环状RNA，并测试了trans-RNA的效果。结果令人振奋：仅仅依靠trans-RNA，就能驱动不含任何IRES序列的环状RNA进行高效翻译。

数据对比极具说服力：当使用柯萨奇病毒B3（CVB3）的IRES时，GFP的翻译水平有所提升；但如果同时加入trans-RNA，翻译水平飙升了18倍。这种协同效应表明，trans-RNA不仅能独立工作，还能与现有的IRES系统强强联手。

为了验证其在体内的治疗潜力，研究人员利用脂质纳米颗粒（LNP）包裹trans-RNA和环状RNA，通过眼眶后注射给予小鼠。在小鼠肝脏中，trans-RNA使得环状nLuc的表达水平提高了惊人的13倍。相比之下，线性mRNA的提升倍数约为7倍。这种差异突显了环状RNA在体内应用中的长效优势，也证明了trans-RNA作为一种“反式激活因子”，能够极大释放环状RNA药物的潜力。

这一发现对于RNA疗法意义重大。想象一下，未来的环状RNA药物不再需要携带冗长的IRES序列，只需要一段短小的互补序列，再配合通用的trans-RNA，就能在体内实现高水平的蛋白表达。这大大降低了RNA药物的设计难度和生产成本。

细胞命运的“编程”：内源基因的精准调控

trans-RNA技术的真正威力，在于它能够对细胞内的内源性基因进行“重编程”。研究人员并未止步于外源报告基因，而是将目光投向了两个关键的代谢调控转录因子：ATF4 和 C/EBPβ。

ATF4 是细胞整合应激反应（ISR）的核心调节因子。它的mRNA包含两个uORF，在营养充足时，uORF2的翻译会阻止主编码区的翻译；只有在氨基酸饥饿等压力条件下，核糖体才会跳过uORF2，启动ATF4蛋白的合成。

研究人员设计了一种靶向ATF4主编码区起始位点的trans-RNA。在HEK293细胞中，即使在营养充足的条件下（本应抑制ATF4表达），转染该trans-RNA也直接诱导了ATF4蛋白的产生。更巧妙的是，当他们设计另一种靶向uORF2起始位点的trans-RNA时，即便在饥饿条件下（本应高表达ATF4），ATF4的翻译也被显著抑制了。

为了确认这一过程的特异性，研究人员进行了核糖体印迹测序（Ribosome Profiling）。数据显示，在饥饿诱导下，内源ATF4 mRNA的主编码区核糖体占有率通常会升高；但加入靶向uORF2的trans-RNA后，主编码区的核糖体密度显著下降，而uORF2上的密度恢复了。这证明trans-RNA精准地操纵了核糖体的分布，且没有改变Atf4 mRNA的总量。

另一个精彩的案例是 C/EBPβ。这个基因通过使用不同的起始密码子，可以产生三种异构体：全长的LAP1和LAP2（作为转录激活因子）以及截短的LIP（作为转录抑制因子）。LAP与LIP的比例（LAP:LIP ratio）直接决定了细胞的代谢状态，例如脂肪细胞的分化。

研究人员利用trans-RNA，像拨动开关一样随意调节这一比例。

阻断分化：当使用靶向uORF的trans-RNA时，核糖体更多地起始于uORF，导致LIP异构体的产生减少，LAP:LIP比例升高。这直接导致3T3-L1前脂肪细胞的分化受阻，油红O染色显示脂滴积累大幅减少。

促进分化：相反，当设计靶向LIP起始位点下游的trans-RNA时，LIP的表达被特异性激活，LAP:LIP比例下降，进而促进了脂肪细胞的分化，脂滴显著增多。

这一系列实验不仅展示了trans-RNA在基础研究中作为解析基因功能的利器，更描绘了其在代谢疾病治疗中的前景：我们可以不改变基因组，不改变mRNA水平，仅仅通过调节特定蛋白异构体的翻译比例，就能逆转细胞的病理状态。

自然界的“伏笔”：天然存在的trans-RNA

在展示了人工合成trans-RNA的强大功能后，研究人员提出了一个深刻的生物学问题：自然界中是否本就存在这样的机制？真核生物基因组中转录大量的反义RNA（Antisense Transcripts），通常我们认为它们通过形成双链RNA来诱导基因沉默（如RNA干扰）。但是，是否有一部分反义RNA，如果带有5'帽结构，实际上是在扮演“激活者”的角色？

利用修改后的CapSeq技术，研究人员在HEK293细胞中富集并测序了带有5'帽的小分子RNA（20-100 nt）。结果令人惊讶：虽然大多数反义转录本被认为源自双向启动子，但这些加帽的反义小RNA在全转录组范围内广泛分布。

数据显示，在所有比对到反义链的加帽小RNA中，有高达 42.9% 的序列映射到了mRNA的5'UTR区域，且在转录起始位点（TSS）附近有显著富集。这与传统的基因沉默模型并不完全吻合。

为了验证这些天然加帽反义RNA的功能，研究人员挑选了两个候选者：靶向 EPRS1 和 ARF1 基因的反义转录本。对于 EPRS1，它拥有多个非经典的uORF。当将人工合成的、带有5'帽的 EPRS1 反义RNA转染进细胞后，EPRS1的蛋白水平显著上升，而mRNA水平不变。对于 ARF1，天然反义转录本对应其下游的一个可变翻译起始位点。引入外源的trans-ARF1成功增加了ARF1较短异构体的表达，而非全长异构体。

这有力地证明，细胞内确实存在天然的 “trans-RNA”。它们不仅仅是转录噪音，而是精密的翻译调控因子。这一发现颠覆了我们对“反义RNA即沉默”的刻板印象，揭示了一个隐藏的、正向的转录后调控维度。

RNA世界的无限可能

这项研究的意义远超出了发明一种新工具。它向我们展示了RNA分子在三维空间中互作的复杂性与灵活性。从工具的角度看，trans-RNA具有巨大的优势：

可编程性 (Programmable)只需设计与目标互补的序列，即可靶向任意mRNA。

不改变基因组相比于CRISPR等基因编辑技术，它不涉及DNA层面的永久改变，安全性更高。

调控精细度它能特异性选择起始密码子，调节蛋白异构体比例，这是目前大多数工具无法做到的。

激活而非抑制填补了特定基因翻译激活工具的空白。

从生物学机制的角度看，它挑战了教科书中关于翻译起始的线性扫描模型。核糖体通过外源RNA的辅助，它可以实现“空间跳跃”。这也引发了我们更多的思考：在疾病状态下（如癌症、神经退行性疾病），细胞内天然trans-RNA的表达谱是否发生了改变？这是否是导致病理蛋白翻译异常的原因之一？我们是否可以开发针对天然trans-RNA的药物，通过干扰这种互作来治疗疾病？

正如研究人员在文中所展示的，一段短短的RNA，配合一个甲基化的帽结构，就能接管庞大复杂的核糖体机器。这再次提醒我们，生命系统的底层逻辑虽然基于化学分子，但其运行方式充满了可重构的逻辑之美。