《自然·医学》：总生存时间延长127%！科学家发现预测肠癌治疗效果的新基因！

BRAF基因的激活突变是结直肠癌（CRC）常见的突变之一，主要突变形式为V600E。

据统计，大约10%的晚期转移性结直肠癌（mCRC）患者携带BRAF-V600E突变[1]。现在我们已经知道，BRAF-V600E可以激活下游MEK-ERK通路，进而导致MYC等转录因子的激活，促进癌细胞增殖。

然而，对于携带BRAF-V600E突变的mCRC患者，单独使用BRAF抑制剂的效果较差。有研究表明，这可能是因为癌细胞会通过反馈性地上调EGFR的其他下游通路来维持细胞增殖[2]。

虽然联合使用BRAF-V600E抑制剂和EGFR抑制剂能够控制CRC肿瘤进展[3]，但是这种联合用药方式仍然对很大部分的晚期CRC患者无效。因此，找到能够预测治疗反应的分子标志物，成为了提高反应率的关键。

近日，由西班牙瓦尔德西布伦大学医院Elena Elez和瓦尔德西布伦肿瘤研究所Rodrigo A. T oledo领衔的的团队，在《自然·医学》杂志发布重磅研究成果。

他们发现，与RNF43野生型患者相比，RNF43突变型组患者的ORR翻倍，疾病进展风险降低49%，死亡风险降低68%。这意味着RNF43突变类型可以作为预测BRAF/EGFR联合抑制疗效的生物标志物[1]。

论文首页截图

接下来我们就一起来看看这个研究是如何展开的。

首先，该研究纳入的患者群体包括98名接受抗BRAF/EGFR治疗的mCRC^BRAF-V600E患者（其中发现队列46名患者，验证队列52名患者），以及68名接受除BRAF抑制剂以外标准疗法（化疗和/或抗血管生成药物）的mCRC^BRAF-V600E患者。

发现队列的患者中61%为女性，年龄中位数为61岁。67%的患者的肿瘤位于右侧结肠，74%的患者有超过1处转移灶，80%的患者的肿瘤具有微卫星稳定（MSS）分型，其余20%的患者为微卫星不稳定（MSI）分型。发现队列的患者接受治疗后的整体客观缓解率（ORR）为44%。此外，在该队列所有患者中，RNF43突变频率为43%，其中MSI肿瘤全部携带RNF43突变，而MSS肿瘤中仅30%携带RNF43突变。

验证队列的患者的情况与发现队列基本一致：60%为女性，年龄中位数为62岁，77%的患者肿瘤位于右侧结肠，63%的患者有超过1处转移灶，75%的患者为MSS分型，其余25%的患者为MSI分型。验证队列患者治疗后的ORR为27%，RNF43突变频率为44%（在MSI中为92%，在MSS中为28%）。

研究人员收集了这些患者的肿瘤和/或血液游离DNA（cfDNA）样本，进行了全外显子组测序（WES）和/或高通量测序（NGS），并将这些数据与患者的治疗反应和生存期进行了相关性分析。

样本收集及实验设计思路

在发现队列中，研究人员通过WES和NGS的数据，将患者分为RNF43突变型组和RNF43野生型组。

总的来看，RNF43野生型患者的ORR为31%，而RNF43突变型患者的ORR为63%。此外，与RNF43野生型患者相比，RNF43突变型组患者的PFS（4.1月 vs 5.6月，HR=0.51）延长1.5个月，OS（7月 vs 15.9月，HR=0.32）延长8.9个月（127%）。这表明，RNF43突变与更好的治疗反应相关。通过统计学分析，研究人员得出，单独使用RNF43突变来预测治疗反应的准确性为67%。

接下来，研究人员根据微卫星稳定性和RNF43突变情况，将肿瘤样本分为三个亚型，分别为MSS-RNF43野生型、MSS-RNF43突变型和MSI-RNF43突变型。他们发现，在发现队列和验证队列中，MSS-RNF43突变型的ORR，显著高于MSS-RNF43野生型和MSI-RNF43突变型。

研究人员又分析了不同亚型的患者的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）。首先，MSS-RNF43突变型患者的PFS优于MSS-RNF43野生型患者和MSI-RNF43突变型患者（10.1月 vs 4.1月 vs 4.4月，HR=0.36）；其次，MSS-RNF43突变型患者的OS也比MSS-RNF43野生型更好（13.5月 vs 7月，HR=0.46）。但值得注意的是，MSI-RNF43突变型患者的OS并没有显著降低。研究人员认为，这很可能是因为这些患者从免疫疗法中获益从而延长了生存期。

不同MSS/MSI和RNF43突变亚型患者的生存分析

作为对照，研究人员还分析了没有接受BRAF抑制剂治疗的MSS-mCRC^BRAF-V600E患者的生存情况。他们发现，在这类患者中，RNF43突变与PFS和OS均不相关。另外，研究人员在MSI肿瘤中也没有发现RNF43突变与患者生存情况的相关性。

这表明RNF43对mCRC^BRAF-V600E患者生存期的预测需要特定的前提，即患者需要接受BRAF抑制剂治疗，以及患者的肿瘤为MSS分型。

最后，研究人员探索了RNF43作为生物标志物的分子机制。他们发现，RNF43突变的位置和蛋白功能在MSI和MSS肿瘤中有着本质的不同。

RNF43是一种RING E3泛素连接酶。野生型的RNF43可以通过促进FZD/WNT受体的降解，来抑制WNT-β-catenin信号通路，进而抑制细胞增殖[4]。

研究人员发现，在所有MSI肿瘤中，RNF43突变集中发生在蛋白的C端，形成p.G659fs*41热点移码突变。由于MSI肿瘤缺乏完善的DNA修复机制，这种移码突变非常普遍。虽然p.G659fs*41突变会造成RNF43蛋白丧失部分功能，但其还可以行使部分野生型蛋白的功能。

相反的，在MSS肿瘤中，RNF43突变则分散在蛋白的N端结构域，包括胞外域（EC）、蛋白酶相关域（PA）、跨膜域（TM）、环指域（RING）和DVL2结合域（DVL）。这些区域的突变包括7个错义突变和16个功能丧失型突变。

为了验证这7个错义突变对蛋白功能产生的影响，研究人员进行了β-catenin荧光素酶报告基因实验。结果发现，在这7个错义突变中，有6个突变会导致RNF43功能丧失。这些功能丧失的RNF43突变体，失去了泛素化和降解FZD/WNT受体的能力，这使得这些受体在细胞膜上积累，进而导致WNT信号通路的持续激活。

现有的研究表明，WNT通路能通过抑制MAPK通路，使上皮细胞在干细胞状态和分化细胞状态之间保持平衡[5]。因此，研究人员猜测，RNF43的功能缺失突变体就是通过激活WNT通路，与BRAF/EGFR抑制剂共同限制MAPK通路，来抑制肿瘤细胞增殖。

MSS患者中RNF43功能丧失型突变导致WNT通路上调

总的来说，该研究揭示了RNF43突变在预测治疗反应和患者生存期方面的价值。在mCRC^BRAF-V600E患者群体中，RNF43功能缺失突变的发生与ORR的改善相关。更重要的是，RNF43功能缺失突变可以作为预测抗BRAF/EGFR组合疗效的生物标志物，这将对实现mCRC^BRAF-V600E患者的精准治疗，以及提高治疗反应率至关重要。

另外，该研究还揭示了MAPK和RNF43-WNT通路在接受抗BRAF/EGFR治疗的肿瘤中的相互作用。我们可以合理猜想，在携带野生型RNF43的mCRC^BRAF-V600E患者中，靶向抑制RNF43或许会提高抗BRAF/EGFR疗法的反应率。

参考文献

[1] Elez E, Ros J, Fernández J, et al. RNF43 mutations predict response to anti-BRAF/EGFR combinatory therapies in BRAFV600E metastatic colorectal cancer [published online ahead of print, 2022 Sep 12]. Nat Med. 2022;10.1038/s41591-022-01976-z. doi:10.1038/s41591-022-01976-z

[2] Li J, Ma X, Chakravarti D, Shalapour S, DePinho RA. Genetic and biological hallmarks of colorectal cancer. Genes Dev. 2021;35(11-12):787-820. doi:10.1101/gad.348226.120

[3] Kopetz S, Grothey A, Yaeger R, et al. Encorafenib, Binimetinib, and Cetuximab in BRAF V600E-Mutated Colorectal Cancer. N Engl J Med. 2019;381(17):1632-1643. doi:10.1056/NEJMoa1908075

[4] Koo BK, Spit M, Jordens I, et al. Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors. Nature. 2012;488(7413):665-669. doi:10.1038/nature11308

[5] Kabiri Z, Greicius G, Zaribafzadeh H, Hemmerich A, Counter CM, Virshup DM. Wnt signaling suppresses MAPK-driven proliferation of intestinal stem cells. J Clin Invest. 2018;128(9):3806-3812. doi:10.1172/JCI99325