从抗氧化“超级英雄”到潜在的DNA损伤风险？Genes and Environ揭示迷迭香酸可通过NADH介导的氧化应激导致DNA损伤

抗氧化剂一直被视为守护我们身体免受自由基侵害的“超级英雄”。其中，迷迭香酸（Rosmarinic acid，RA）作为一种备受瞩目的天然抗氧化剂，广泛存在于多种植物中，如迷迭香、留兰香等，因其具有抗炎、抗癌、抗菌等诸多益处而被广泛应用于健康产业。然而，Genes and Environ近期一项研究“Rosmarinic acid, a natural polyphenol, has a potential pro-oxidant risk via NADH-mediated oxidative DNA damage”却揭示了RA可能隐藏的“另一面”——在特定条件下，它竟然有可能通过NADH介导的氧化应激对我们的DNA造成损伤。这一发现无疑给我们敲响了警钟，让我们重新审视RA的安全性。

为了明确RA氧化DNA损伤的机制，研究团队利用分离的DNA，在金属离子存在的情况下，对RA及其类似物异迷迭香酸（isorinic acid）诱导的DNA损伤进行了深入分析，采用高效液相色谱（HPLC）系统结合电化学检测器（ECD），测量了小牛胸腺DNA中8-oxodG的形成，以此作为氧化损伤DNA的指标。同时，使用³²P-5'-端标记的DNA片段，研究了RA与Cu(II)诱导的DNA损伤及其位点特异性。

实验结果

1. RA与金属离子及NADH共同作用下8-oxodG的形成
研究发现，在小牛胸腺DNA中，RA与Cu(II)共同作用时，8-oxodG的形成显著增加，且呈现浓度依赖性。而RA与Fe(III)共同作用时，几乎不增加8-oxodG的形成。当加入内源性还原剂NADH时，RA与Cu(II)诱导的8-oxodG形成显著增强，在低浓度RA（0.1-0.5 μM）时，增强效果约为30倍。RA类似物异迷迭香酸与Cu(II)共同作用也能增加8-oxodG水平，但其诱导量仅约为RA的一半，NADH同样增强了异迷迭香酸诱导的8-oxodG形成。

图1. 在金属离子和NADH存在下，用RA和异迷迭香酸处理的小牛胸腺DNA中形成了8-oxodG

2. RA与Cu(II)对³²P-标记DNA片段的损伤作用
通过对³²P-5’-端标记的DNA片段分析，研究人员发现，在Cu(II)存在的情况下，RA以浓度依赖的方式导致DNA断裂，而哌啶处理进一步增强了这种断裂效应。这表明RA与Cu(II)不仅引起了DNA链的断裂，还导致了碱基的修饰。

3. ROS清除剂和Cu(I)螯合剂对RA与Cu(II)诱导DNA损伤的影响

为了确定导致氧化DNA损伤的活性氧物种（ROS）类型，研究团队测试了多种ROS清除剂和Cu(I)螯合剂的作用。结果显示，过氧化氢酶（H₂O₂清除剂）和浴铜灵（Cu(I)螯合剂）能够抑制RA与Cu(II)诱导的DNA损伤。而典型的・OH自由基清除剂（如乙醇、甘露醇和甲酸钠）则无抑制作用，不过甲硫氨酸（可清除除・OH外的多种ROS）能够阻止DNA损伤，超氧化物歧化酶（SOD）同样未表现出抑制效果。这些结果表明，H₂O₂、Cu(I)和除・OH外的ROS参与了RA与Cu(II)诱导的DNA损伤。

4. RA与Cu(II)诱导DNA损伤的位点特异性
利用Maxam-Gilbert测序法，研究人员确定了RA与Cu(II)诱导的DNA损伤模式。结果表明，RA与Cu(II)主要在来自人类p16肿瘤抑制基因和c-Ha-ras-1原癌基因的DNA片段中的胸腺嘧啶（T）和一些胞嘧啶（C）残基处诱导DNA断裂，尤其是在哌啶处理后。由于・OH导致的DNA断裂通常没有明显的位点特异性，因此RA与Cu(II)诱导的DNA损伤位点特异性提示除・OH外的ROS参与了这一过程。

图2. 迷迭香酸（RA）在³²P-5’-末端标记的DNA片段中诱导DNA损伤的位点特异性

结果讨论

本研究揭示了RA在Cu(II)存在下通过氧化还原循环反应诱导DNA损伤的机制。RA的儿茶酚基团在Cu(II)介导下发生自氧化，生成相应的半醌自由基和醌形式，同时Cu(II)被还原为Cu(I)，并产生超氧阴离子自由基（O₂^-），后者歧化为H₂O₂。随后，Cu(I)与H₂O₂形成复合物（可能是Cu(I)-氢过氧化物），从而诱导氧化DNA损伤。NADH可能将醌和半醌自由基再次还原为RA，进一步增加ROS的生成，加剧氧化DNA损伤。

图3. 在Cu（II）和NADH存在下，RA诱导DNA损伤的可能机制

临床试验中，参与者每日摄入含200–500 mg RA的植物提取物，人体血清中RA的最大浓度可达约0.16 μM。本研究发现，0.1μM的RA在生理相关浓度的Cu(II)（20 μM）和NADH（100 μM）存在下即可诱导氧化DNA损伤，这表明RA的使用，尤其是在治疗用途中，可能在体内导致氧化DNA损伤。尽管当前实验条件下RA与EDTA-Na-Fe(III)未对分离的DNA造成损伤，但细胞生物学和计算研究提示RA可能引起铁介导的ROS生成，因此铁在RA诱导的体内氧化DNA损伤中可能也发挥作用，未来还需利用细胞和动物模型进行深入研究。

综上所述，本研究表明RA可通过与铜和NADH的氧化还原循环反应诱导Cu(I)-氢过氧化物形成，进而导致氧化DNA损伤。NADH对氧化DNA损伤的显著增强作用提示，在评估多酚的促氧化活性时，需要特别关注其与内源性还原剂的相互作用。这一研究强调了在考虑RA潜在治疗应用时，进一步研究其促氧化和遗传毒性风险的必要性，为RA在医药领域的安全应用提供了重要的理论依据。（生物谷Bioon.com）

参考文献：

Kobayashi, H., Hirao, Y., Kawanishi, S. et al. Rosmarinic acid, a natural polyphenol, has a potential pro-oxidant risk via NADH-mediated oxidative DNA damage. Genes and Environ 46, 13 (2024). https://doi.org/10.1186/s41021-024-00307-7