STTT | SARS-CoV-2的RNA结合亲和力：武汉大学陈宇团队揭秘关键氨基酸位点的作用

冠状病毒（CoV）是可以感染人类和其他哺乳动物的普遍病原体。众所周知，SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 等高致病性冠状病毒毒株会导致严重急性呼吸系统综合症（SARS）和 COVID-19，对人类健康构成严重挑战。1SARS-CoV-2和SARS-CoV都是β冠状病毒属的成员，都是包膜病毒。该基因的一端具有5′-帽结构，另一端具有3′-poly-A尾巴。ORF1a和ORF1b占据了整个基因组序列的2/3，位于5'末端。由ORF合成的聚合物蛋白pp1a和pp1ab通过病毒蛋白酶进行蛋白水解裂解，形成16种非结构蛋白（nsps）。这些 nsp 对于在双膜囊泡（DMV）内构成复制-转录复合物（RTC）至关重要。此外，这些 nsps 还执行各种功能。

在真核细胞的细胞质中，未加帽的RNA被5′-3′核酸外切酶迅速降解。因此，帽结构通常被认为是RNA分子稳定性的重要标志。冠状病毒是已知最大的RNA病毒，其基因组RNA可能是细胞质中最大的RNA分子。冠状病毒的适应性进化设计了某些策略来隐藏其RNA中固有的5'末端三磷酸。主要方法涉及帽结构的构建，用于模拟宿主的mRNA并促进有效的病毒复制。

大量证据表明，冠状病毒通过传统方式参与封帽过程。这意味着在三磷酸RNA中，β-磷酸和γ-磷酸之间的磷酸二酯键被RNA三磷酸酶(nsp13)水解，产生具有二磷酸5'末端(5'-PPN)的RNA。随后，鸟嘌呤核苷通过鸟苷酸转移酶(nsp12)在该位点上酶促结合，生成关键中间体(GpppN)。在甲基供体SAM (s -腺苷甲硫氨酸)存在下，GpppN通过n7-甲基转移酶(nsp14, n7-MT酶)和2'-o-甲基转移酶(nsp16, 2'-o-MT酶)进行甲基化，从而产生帽-0结构(7MeGpppN)和帽-1结构(7MeGpppNm) 。

nsp16 L36I/N138H/I153L突变体抑制了SARS-CoV-2的复制（Credit: Signal Transduction and Targeted Therapy）

近年来，课题组对新冠病毒RNA加帽和甲基化的分子机制，以及N7-MT酶和2′-O-MTase的活性特征进行了研究。Züst等人，Daffis等人和本研究小组证明，这些病毒帽结构在抵抗IFN介导的抗病毒反应中起着关键作用，提示病毒RNA的核糖甲基化可能影响病毒发病机制。这些广泛的研究通常采用将相关突变引入2′-O-MTase的关键活性中心（K-D-K-E 基序的策略。这会导致nsp16失活。所得功能受损的蛋白质用于研究2′-O-甲基化的生理特征和重要性。然而，K-D-K-E 基序在多种病毒和哺乳动物 2′-O-MTase 中显示出高度保守性。到目前为止，在自然界中尚未发现这些基序残基的天然变体。因此，全面了解2′-O-甲基转移酶，有助于理解、分析和预测相关病毒爆发带来的潜在威胁。

在这项研究中，观察到 SARS-CoV-2表现出比SARS-CoV更强的2′-O-MTase活性，其特点是具有更明显的帽序列特异性和更高的效率。除K-D-K-E基序外，Leu-36、Asn-138和Ile-153残基被确定为导致2′-O-MTase活性差异的关键决定因素。研究利用安全的复制子系统(具有转录和复制能力的SARS-CoV-2病毒样颗粒，trVLP-WT, trVLP-3Mut)将这些突变(从SARS-CoV-2到SARS-CoV)引入病毒。有趣的是，这种替代导致了病毒复制的显著减少，并伴有细胞培养物中促炎趋化因子的强烈上调。这种诱导效应依赖于细胞质RNA传感器MDA5和LGP2的协同感应。

该研究使用RNA-seq在Caco-2细胞中进行了无偏倚的转录组筛选，并证实这些突变诱导了增强的先天免疫反应。此外，基于慢病毒-N 转导生成了 SARS-CoV-2 trVLP感染的K18-hACE2 敲入（KI）小鼠模型。因此，研究证明，重组SARS-CoV-2在一定程度上缺乏2′-O-甲基化会导致较差的复制效率和更严重的体内疾病。这些发现表明，除K-D-K-E基序外，nsp16残基的自然突变可能通过影响病毒毒力和引发强大的炎症反应而带来潜在风险。不同水平的 2′-O-甲基化修饰对免疫和炎症反应有显着影响，因此，确定 2′-O-甲基化的最佳调节对于设计更有效、免疫原性更低的 mRNA 疫苗至关重要。