Nat Biomed Eng：深度剖析！基于CRISPR–Cas13的新技术有望简单快速检测肾脏移植患者的感染风险和排斥反应！

2020年4月25日 讯 /生物谷BIOON/ --日前，一项刊登在国际杂志Nature Biomedical Engineering上题为“A CRISPR-based assay for the detection of opportunistic infections post-transplantation and for the monitoring of transplant rejection”的研究报告中，来自麻省理工学院等机构的科学家们通过研究基于CRISPR开发出了一种新型诊断技术来检测器官移植后患者的感染风险，同时监测患者对移植器官的排斥反应。

在器官移植过程中，感染和排斥是引发移植失败的主要原因，其是通过免疫抑制的状态联系到一起的，为了能够尽可能早地诊断并且治疗这些情况，并改善患者的长期预后，研究人员就需要对接受器官移植的患者进行持续性监测；这项研究中，研究人员基于CRISPR–Cas13开发出了一种快速廉价的检测方法，其能准确检测来自病人机体血液和尿液样本中BK多瘤病毒（BKV）和巨细胞病毒（CMV）的DNA，以及经历急性肾移植排斥反应患者尿液中水平升高的CXCL9 mRNA（移植物排斥的标志物）；BKV、CMV和CXCL9 mRNA在急性细胞肾移植排斥反应中的表达水平会升高。

图片来源：Broad Institute of MIT and Harvard

研究者Michael Kaminski表示，提到CRISPR很多人第一时间就会想到基因编辑，但实际上其在其它应用上也拥有巨大的亲历，尤其是进行简洁快速的诊断；目前，肾脏移植患者会选择服用抑制免疫系统的药物来减少器官排斥的风险，但这也同时也会增加患者因感染而患病的风险，因此密切监测患者的感染状况和排斥反应，以及平衡其二者就显得尤为重要了，研究人员通常会利用血液检测和肾脏活组织检查来完成上述监测，然而这是一项非常耗时、昂贵且更具侵入性的工作。

这项研究中，研究人员CRISPR–Cas13技术开发出了一种检测试剂盒，在对100多名感染BKV和CMV的患者的临床样本在不同病毒载量范围内进行检测后，研究者发现了这种检测手段具有较高的诊断效率；这种试剂盒能够使用两步法，首先其能对尿液样本中的病毒靶向DNA进行扩增，以便于仅有单分子存在的情况下CRISPR也能检测到靶标；随后研究人员使用了一种称之为SHERLOCK的特殊CRISPR–Cas13步骤来优化病毒DNA的检测过程，检测过程就好像使用一般的测孕试纸海洋，当将检测试剂条浸润到样本中时，如果检测条出现一条线就表明结果是阴性，如果是两条线就证明存在病毒感染。此外，研究人员还利用试剂盒对排斥标志物CXCL9进行检测，作为mRNA，其能被分离并且扩增，随后利用CRISPR-Cas13对其进行靶点检测。对于非常低的目标浓度，检测试纸条也会出现不能确定的第二条条带，这或许就会导致研究人员对结果产生误判，基于此，研究人员开发出了一款智能手机app，其能客观地分析试纸条带的结果，并给出准确的结果判读。

快速有效的POCT（即时检测）技术能帮助患者在资源匮乏的环境中进行疾病的早期诊断成为可能，同时还能帮助患者实现疾病的自我监测，这项研究中，研究人员基于CRISPR-Cas13开发的新型诊断试剂盒就能对器官移植受体患者样本中的CMV和BKV进行检测，同时研究者还运用SHERLOCK步骤成功实现了对患者样本中CXCL9 mRNA的检测；这种新型工具或有望作为器官移植患者移植后发现进行早期排斥反应和监测的工具。

研究人员主要针对BKV、CMV和CXCL9 mRNA在临床相应浓度下的定性检测，在许多临床情况下，精确地对病毒载量和生物标志物水平的改变进行定量检测是非常有用的，因此，研究后期还会扩展该工具实现其定量化检测；同时这或许也会加强基于CRISPR的诊断能力，因为其能检测非常细微的改变，此外，尽管大部分步骤都可以为POC检测进行优化，但用于检测mRNA的样本分离仍然需要基于柱状的方法，因此，后期研究人员还需要深入研究来优化简单分离mRNA的步骤。而且后期研究人员还需要纳入更多的患者样本并进行前瞻性分析，这样才能帮助研究人员于当前的临床实践进行系统性地比较；尽管当前研究重点关注细胞所介导的排斥反应（影响肾脏移植受体最常见的排斥反应），下一步研究人员将会扩大并验证对排斥反应的分析，从而检测抗体所介导的排斥反应。

总的来讲，本文研究展示了基于CRISPR-Cas13的技术在肾脏移植患者机体中检测排斥反应和感染风险中的应用，该技术还能用于其它实体器官的移植及免疫介导的肾脏疾病研究中，比如狼疮性肾脏炎症等。这种方法成本低、使用方便且速度快，能够实现频繁检测和早期诊断，为了推进其临床应用，后期研究人员还会进一步验证这些研究发现，并阐明这种技术在改善肾脏移植患者长期治疗预后方面的临床应用。（生物谷Bioon.com）

参考资料：

【1】Diagnostics, meet CRISPR

【2】Kaminski, M.M., Alcantar, M.A., Lape, I.T. et al. A CRISPR-based assay for the detection of opportunistic infections post-transplantation and for the monitoring of transplant rejection. Nat Biomed Eng (2020). doi：10.1038/s41551-020-0546-5