抗肝纤维化新突破！Nature Chemical Biology：天然小分子通过靶向载脂蛋白L2来缓解肝纤维化

肝纤维化是肝脏试图修复及取代受损细胞而形成的异常大量瘢痕组织，可由病毒感染、酗酒和代谢、胆汁淤积或自身免疫性疾病引起，其特征为肝脏组织中肝星状细胞（Hepatic stellate cells，HSCs）的激活和细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）的过度沉积。持续性肝纤维化可导致肝脏结构扭曲、肝功能障碍受损、肝硬化，最终导致肝细胞癌或死亡。然而，目前尚未有针对肝纤维化的药物获批上市，新型抗肝纤维化药物的开发是亟待解决的临床问题。

近日，中山大学尹胜/郭剑平研究团队在Nature Chemical Biology发表了题为A natural small molecule alleviates liver fibrosis by targeting apolipoprotein L2的研究论文。该团队通过对大戟科二萜类化合物库进行高内涵筛选，获得了具有强效抗肝纤维化活性的惕各烷型二萜小分子DP，确定了其直接作用靶点载脂蛋白L2（APOL2）并揭示了其作用机制，为抗肝纤维化药物的开发提供了重要参考。

纤连蛋白（Fibronectin，FN）是重要ECM成分和肝纤维化生物标志物，通常在TGF-β1诱导的纤维化反应早期由活化的HSCs合成。研究人员通过建立高内涵筛选系统，使用免疫荧光监测TGF-β1刺激的LX-2细胞（人肝星状细胞系）中FN表达，对大戟科植物中分离的195种天然二萜类化合物进行筛选，发现了具有强效抗纤维化作用的含有5/7/6/3碳环系统的虎杖二萜类化合物DP。实验结果表明，DP在10 μM浓度下能够将FN水平降低96.7%，能够剂量依赖性地抑制TGF-β1刺激的LX-2和JS-1（小鼠肝星状细胞系）中的FN、I型胶原蛋白和α-SMA的蛋白表达，其效果优于临床试验药物PFD。同时，DP还下调了这些纤维化标志物的mRNA水平。

在小鼠初代HSCs中，DP同样显著减少了纤维化蛋白的表达。此外，DP在由多种促纤维化细胞因子（如PDGF、CTGF、LPS和Ang II）诱导的HSC活化模型中，显著降低了α-SMA和ECM蛋白的表达。在其他器官来源的成纤维细胞中，DP也表现出类似的效果，表明DP可能具有广谱的抗纤维化作用。在LX-2细胞的三维细胞球模型中，DP有效抑制了TGF-β1诱导的α-SMA表达。此外，DP在有效浓度范围内对细胞无明显的细胞毒性。上述结果表明，DP能有效抑制HSC活化，且具有潜在的广谱抗纤维化作用。

图1：DP能有效抑制HSC活化

接着，研究人员评估了DP在肝纤维化小鼠模型中的抗纤维化效果，结果显示，DP能够剂量依赖性地减轻肝脏炎症浸润水平、肝细胞损伤水平和纤维化程度。低剂量DP（20 mg/kg）的抗纤维化效果与高剂量PFD（200 mg/kg）相似。在有效剂量下，DP对肺、心脏、肝脏、脾脏和肾脏无明显毒性，且不影响关节软骨和骨结构。

图2：DP有效缓解CCl4-诱导和DDC诱导的小鼠肝纤维化

为确定DP的靶点，研究人员采用光亲和标记法，将DP的20-OH修饰为二氮杂茂炔基，合成了可点击的光亲和探针（DP-PT），通过胶内荧光扫描、靶点垂钓、竞争性结合实验、体外蛋白结合实验、细胞热转移实验和荧光共定位分析证实了APOL2为DP的直接作用靶点。通过APOL2片段化蛋白pull-down检测、光交联质谱分析、分子对接模拟和蛋白点突变验证实验，发现DP主要与APOL2的MD 186−266 aa区域相互作用，N212和V216是结合的关键残基。

图3：DP直接靶向APOL2

图4：DP与APOL2的结合位点

为确定APOL2与肝纤维化的关联，研究人员从Gene Expression Omnibus（GEO）数据库中查询了APOL2基因表达数据集，分析了肝组织中APOL2的转录水平。结果显示，APOL2在酒精性肝硬化、乙型肝炎病毒（HBV）相关肝癌和非酒精性脂肪肝（NASH）的肝组织中转录水平显著升高。纤维化肝组织中的APOL2水平高于正常肝组织，并与肝纤维化程度和α-SMA水平正相关。

在肝纤维化小鼠模型中，APOL2的mRNA和蛋白质水平显著升高。在不同促纤维化刺激（如TGF-β1、PDGF、CTGF、LPS和Ang II）下，APOL2表达水平也显著升高。APOL2主要位于纤维化间隔，且与HSCs（α-SMA阳性）共定位，但与肝细胞、窦状内皮细胞、Kupffer细胞不共定位。在人类纤维化肝组织中也观察到APOL2与HSCs共定位，表明APOL2主要在活化的HSCs中诱导。

为了探索APOL2在肝纤维化过程中的作用，研究人员操控了LX-2细胞中的APOL2表达，发现APOL2缺乏可以减轻肝细胞中的纤维化标志物表达。在小鼠实验中，APOL2敲除可以显著抵抗CCl4诱导的肝损伤和纤维化。此外，研究人员还发现DP通过抑制APOL2来发挥抗纤维化作用，APOL2是抗肝纤维化的一个新的潜在治疗靶点。

图5：APOL2与肝纤维化进程有关，APOL2缺乏可抑制肝纤维化

进一步的研究发现，DP处理或APOL2耗竭对TGF-β1/Smad2/3信号通路没有明显影响，但DP可以通过阻断APOL2与SERCA2的相互作用来恢复ER钙离子稳态，并减少由TGF-β1引发的PERK依赖的ER应激。DP的抗ER应激效果依赖于APOL2，且其抗纤维化作用主要通过下调PERK-HES1信号通路实现。动物实验进一步证实了DP或Apol2耗竭显著降低了小鼠肝纤维化组织中的p-PERK、p-eIF2α、ATF4和HES1水平，表明DP通过抑制APOL2-SERCA2-ER应激介导的PERK-HES1轴来缓解肝纤维化。

图 6：DP 通过抑制APOL2-SERCA2-ER应激介导的PERK-HES1轴来缓解肝纤维化

综上所述，本研究利用高内涵筛选系统发现了具有强效的抗肝纤维化作用的大戟科二萜类化合物DP，并确定了APOL2为DP的直接作用靶标，DP的抗纤维化效应依赖于APOL2介导的ER应激通路。本研究为肝纤维化治疗提供了新的候选化合物，并确认了APOL2是抗肝纤维化的一个新的潜在治疗靶点，为抗肝纤维化药物的开发提供了重要参考。（生物谷Bioon.com）

参考文献：

Gan L, Jiang Q, Huang D, et al. A natural small molecule alleviates liver fibrosis by targeting apolipoprotein L2. Nat Chem Biol. Published online August 5, 2024. doi:10.1038/s41589-024-01704-3