Nature：揭示肢体再生中位置记忆的分子密码

在生物体的发育过程中，细胞会根据其在胚胎中的位置获得特定的“位置信息”，这种信息以基因表达和染色质的空间差异形式保留下来【1】。这些位置信息不仅在胚胎发育中起着关键作用，而且在成年后的组织再生中也发挥着重要作用。蝾螈的肢体再生是一个研究位置信息及其在再生中作用的理想模型系统。在蝾螈的肢体中，位置信息被功能性地编码在结缔组织细胞中。这些细胞沿着肢体的近端-远端、背侧-腹侧和前部-后部轴显示出差异化的基因表达和染色质修饰。当肢体被截肢后，来自不同肢体区域的细胞会迁移并在截肢表面汇聚，形成再生芽基。这些细胞之间的相互作用对于再生生长是必需的。这种位置记忆使得细胞能够创造出无缝整合再生部分与剩余残肢组织的模式【2】。然而，位置记忆的分子基础以及位置记忆是否可以被改变仍然有很大的未知。

前部-后部轴在启动和维持肢体再生中起着关键作用。截肢后，前部芽基细胞分泌的Fgf8与后部芽基细胞分泌的Shh相互作用，通过一个进化上保守的正反馈回路诱导肢体的生长。通过操纵前部-后部的相互作用，可以产生可预测的结果。有趣的是，Fgf配体在大多数脊椎动物的远端、顶外胚层脊中表达，而不是像蝾螈那样在前部表达。因此，前部-后部相互作用在肢体再生中的关键作用源于Fgf和Shh的空间重排【3】。尽管如此，下游机制似乎相似，因为在蝾螈肢体再生过程中抑制或错误表达Shh会导致类似鸡（Gallus gallus）和小鼠（Mus musculus）肢体发育中的指趾减少或扩增表型。重要的是，Fgf8和Shh在未受伤的蝾螈肢体中并不表达。然而，细胞如何保留前部-后部位置记忆以适当地启动Fgf8和Shh的表达尚不清楚。

为了研究前部-后部的位置信息，近日，来自奥地利科学院分子生物技术研究所（IMBA）的E. M. Tanaka团队在Nature上在线发表题为Molecular basis of positional memory in limb regeneration的文章，使用荧光报告基因、谱系追踪以及遗传或药理学干扰等方法研究了活体蝾螈（墨西哥钝口螈，Ambystoma mexicanum），发现了一个Hand2-Shh正反馈回路，它负责后部身份的维持。通过在再生的前部细胞中强制启动这个回路，可以使它们的位置记忆后部化，使它们在随后的截肢后能够表达Shh，从而利用位置记忆机制改变了再生细胞的信号输出，不仅揭示了肢体再生中位置记忆的分子机制，还展示了位置记忆的可塑性，为再生医学提供了新的视角。

本文研究人员首先研究了再生过程中后部表达Shh细胞的来源（图1）。为了探索在发育过程中表达Shh的细胞是否在肢体中持续存在，并在损伤后作为表达Shh细胞的来源，研究人员利用遗传谱系追踪技术，通过在胚胎期标记Shh细胞，并在肢体再生过程中追踪这些细胞的后代，发现在再生的肢体中，大多数新产生的Shh阳性细胞并非来源于胚胎期的Shh谱系细胞，而是由其他细胞类型转化而来，表明非Shh谱系细胞在再生过程中也能表达Shh。而通过手术移除胚胎期Shh细胞后，再生肢体仍能正常表达Shh并完成再生，进一步证实了非Shh谱系细胞在再生过程中能够表达Shh，且胚胎期的Shh细胞对于再生过程中Shh的表达并非必需。

图1 蝾螈肢体发育（a）和再生（b）示意图。前部（anterior）Fgf 8和后部（posterior）Shh相互作用促进肢体生长。

为了鉴定诱导后部细胞表达Shh的基因，研究人员对前部和后部细胞进行了转录组比较分析。分析发现，前部和后部细胞在约300个基因上存在差异表达，其中Hand2基因在统计上显著地主导了后部细胞的表达特征。Hand2编码一个bHLH转录因子，在在小鼠、鸡和斑马鱼的肢芽中向后部表达并诱导Shh表达。尽管Hand2尚未被证实参与后部位置记忆，但其细胞内功能与位置信息的持续性一致。此外，其他在小鼠肢体发育中具有前部-后部差异表达的转录因子也在蝾螈肢体中表现出相应的表达模式。GO分析显示，差异表达基因富集在“细胞外基质”和“细胞粘附”类别中，这些分子可能在前部和后部肢体中产生不同的信号环境。

随后，研究人员通过实验发现，Hand2在后部细胞中持续表达，并在再生过程中显著上调。通过遗传谱系追踪，证实胚胎期Hand2细胞在成年肢体和再生肢体中均有贡献，且能产生Shh细胞。这表明Hand2细胞在损伤后可表达Shh，对Shh激活至关重要。进一步地，研究人员通过CRISPR-Cas9技术对蝾螈的Hand2基因进行编辑，构建Hand2基因敲除（CRISPant）动物，以研究Hand2在肢体再生中的作用。

实验结果显示，Hand2 CRISPant在肢体发育中表现出较高的致死率和肢体缺陷。而在再生过程中，几乎所有的Hand2 CRISPants都再生出较少的指头，即使原本指头数量正确的个体也不例外。实验还发现，Hand2对于Shh的表达和后部身份的维持至关重要。在副肢模型（AML）中，Hand2 CRISPants的后部皮肤移植到前部伤口时，无法诱导额外肢体的形成，而对照组则可以。由此表明Hand2对于维持后部身份和Shh的表达是必需的，Hand2的缺失会导致后部身份的丧失，但并不会使它们自动获得前部身份。

与此同时，研究人员构建Hand2在肢体芽和再生芽基的间充质细胞中过表达的蝾螈模型，发现Hand2过表达能够诱导前部细胞异常表达Shh报告基因，并导致多指畸形，甚至在某些情况下诱导额外肢体形成。当Hand2在所有结缔组织细胞中均匀过表达时，会消除前部-后部的差异，导致肢体发育异常。RNA测序分析显示，Hand2过表达诱导的基因表达变化与后部化一致。这些结果表明，Hand2过表达足以诱导细胞的后部身份，并改变其再生和信号输出特性。

进一步地，研究人员通过细胞移植实验，将带有Alx4:mCherry_Hand2:EGFP双报告基因的蝾螈的前部或后部细胞移植到未标记宿主肢体的相反位置。实验发现，在未受伤的稳态条件下，前部细胞保持前部身份（mCherry阳性），后部细胞保持后部身份（Hand2:EGFP阳性）。但在肢体截肢后的再生过程中，移植的前部细胞进入芽基后开始表达Hand2:EGFP，显示出后部化身份，而宿主肢体的残肢细胞仍保持前部身份。这表明前部细胞在再生过程中能够改变其位置记忆，转变为后部细胞。进一步的实验通过再次截肢验证了这些细胞的后部记忆状态是稳定的，因为它们在第二次截肢后仍能表达Shh。相反，移植的后部细胞在再生过程中保持其原有的后部记忆，并在第二次截肢后继续表达Shh。

这些结果表明，位置记忆在稳态下是稳定的，但在再生过程中是可塑的。此外，使用Shh信号通路抑制剂BMS-833923处理再生中的移植细胞，可阻止其后部化，表明Shh信号是必需的。而向再生芽基中注射Shh激活剂SAG，则能诱导前部细胞获得后部记忆，且这种记忆在后续再生和再次截肢中得以维持。这些结果表明，Shh信号不仅对于前部细胞的后部化是必需的，而且足以诱导这种转变，从而揭示了Shh信号在再生过程中对位置记忆重编程的关键作用。

综上所述，本研究通过研究蝾螈肢体再生中的位置记忆机制，揭示了Hand2-Shh正反馈回路在维持后部身份中的关键作用，并展示了位置记忆在再生过程中的可塑性。研究提出了一个通过肢体再生来传播位置记忆的模型（图2），证明前部细胞在再生过程中可以通过Shh信号的短暂激活被后部化，而这种后部化记忆在后续再生中是稳定的。这一发现不仅为理解肢体再生中位置记忆的分子基础提供了重要线索，还为再生医学提供了新的视角，特别是在如何通过改变细胞的位置记忆来促进组织再生方面。此外，研究还发现后部细胞在再生过程中保持其原有的后部记忆，这表明位置记忆的稳定性与可塑性在再生过程中是共存的。这些结果为未来的研究提供了新的方向，特别是在探索如何利用位置记忆机制来实现更有效的组织再生和修复。

图2

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-025-09036-5

1. Chang, H. Y. et al. Diversity, topographic differentiation, and positional memory in human fibroblasts. Proc. Natl Acad. Sci. USA 99, 12877–12882 (2002).

2. Otsuki, L. & Tanaka, E. M. Positional memory in vertebrate regeneration: a century’sinsights from the salamander limb. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 14, a040899 (2022).

3. Nacu, E., Gromberg, E., Oliveira, C. R., Drechsel, D. & Tanaka, E. M. FGF8 and SHH substitute for anterior–posterior tissue interactions to induce limb regeneration. Nature 533, 407–410 (2016).