科学家提出新型纳米通道检测系统，能精准获取疾病的动态信息

“记得小时候偶然看到父亲在实验室做焰色反应实验，那绚丽的颜色深深刻在我的脑海里。这是我对化学的初印象，也是引导我走上科研道路的契机。”中国地质大学（武汉）娄筱叮教授说。

▲图 | 娄筱叮（来源：资料图）

作为一名教师兼科研人员，娄筱叮是另一种版本的“长大后我就成了你”。父亲是老师，她也是老师；父亲爱化学，她也爱化学。

其表示：“在很多人眼中化学研究是枯燥乏味的，不少人打心底害怕做科研。其实这都是刻板印象，现在的科研条件比以前好太多，科研工作也给了我更多独立思考的空间，以及可以探索未知的快乐。”

前不久，娄筱叮联合同校的夏帆教授利用纳米通道外表面的润湿性变化，成功检测了肿瘤标志物“基质金属蛋白酶-2（MMP-2）”。

通过调节两亲性肽之中苯丙氨酸的数量，可以调节外表面的疏水性，从而改变离子电流的变化比，进而可以降低检测限的数值大小。

（来源：ACS Nano）

实验结果显示，本次检测系统能够检测细胞分泌的 MMP-2。基于这一系统该团队证明 MMP-2 的表达与细胞周期存在相关性，并且在细胞 G1/S 期处于最高水平。

此前，人们主要研究纳米通道外表面，对于它的润湿性学界普遍较少关注。而该成果全面、系统地阐述了润湿性的作用和机制，并排除了其他因素的影响。

研究中，他们选择多种肿瘤细胞过量表达的基质金属蛋白酶作为主要研究对象。这种酶的底物是多肽序列，能够被特异性地切割。

随后，基于纳米通道检测系统的浸润性变化，可以对这种酶进行检测。

一开始，纳米通道外表面探针在设计上，并不具有明显的普适性。当该团队更换三个单元中的酶响应序列时，就能对检测不同的蛋白酶，比如弗林蛋白酶、凋亡蛋白酶、组织蛋白酶等。

蛋白酶的异常表达与疾病的发生发展密切相关，因此本次纳米通道系统有望作为一款便携通用的肿瘤或疾病标志物检测策略来辅助临床诊断。

目前，课题组已经尝试开展产业孵化，例如其正在打造基于纳米孔道芯片的前列腺癌早期筛查设备。

进一步地，他们打算将该团队的表面定向偶联技术搭载到上述产品之上。这样一来对于那些与疾病相关的蛋白来说，就能精准地获取它们的动态变化信息。

成功检测肿瘤标志物“基质金属蛋白酶-2”

据介绍，此前以细胞膜上的通道蛋白为启发，学界研发了固态仿生纳米通道。其具备较高的机械强度、多样化的修饰手段、孔隙尺寸可被调节等优势。

经过特定捕获探针的修饰，以及生物靶标与捕获探针的相互作用，纳米通道的尺寸、电位、疏水性等微小变化，都有可能让离子电流出现明显变化，从而可以分析多种尺度的生物靶标。

而在这些生物靶标中，包括纳米级的离子、小分子、核酸、蛋白质到微米级的细胞。

然而，目前基于纳米通道的检测系统，大多都是基于纳米通道内壁来做修饰探针。这意味着生物靶标必须进入纳米通道，以确保与探针的相互作用。

当以蛋白质作为靶标时，由于纳米通道内部是一个封闭空间，因此尺寸较大的蛋白质很难到达探针的识别位置，从而导致检测效率偏低。

而且，在这种情况下要想实现生物靶标尺寸和孔径的完美适配性，往往要面对重现性较差的问题。那么，能否利用纳米孔的外表面来实现检测？

此前，娄筱叮和夏帆曾尝试区分纳米通道的内表面和外表面，并通过区域化修饰揭示了不同表面的角色。

例如，通过监控纳米通道外表面的表面电荷的变化，可以用来检测各种生物靶标。

考虑到固态表面电荷仪器的稀有性，以及电荷测量容易受到多种因素的影响，该团队提出了上述新策略：即利用纳米通道外表面浸润性的变化，来检测“基质金属蛋白酶-2”这一肿瘤标志物。

具体来说，他们选择了一种多肽材料，其具有可编辑性、生物活性和多样性等优势。其将这种多肽材料作为外表面的修饰探针，从而形成基于多肽的外表面探针。

这种探针由三个单元组成：半胱氨酸组成的亲水单元、MMP-2 响应识别单元、以及由多个苯丙氨酸组成的疏水单元。

当与 MMP-2 作用之后，由于疏水单元的离开，纳米通道外表面的亲水性开始增加，进而让离子电流出现增加。

此外，疏水单元的数量也得到了精准调节，从而让 MMP-2 的检测灵敏度得以提高。这让纳米通道能够成功检测到细胞分泌的 MMP-2，并发现 MMP-2 的分泌与细胞周期有关。假如在细胞 G1/S 期进行检测，还可以获得更高的准确性。

而在此前，只有当纳米通道的内外表面不作区分时，浸润性才能起到协同作用。而该课题组证实纳米通道外表面的浸润性变化，可以影响它的离子电流。

由此可见，调节纳米通道外表面的浸润性，对于标志物检测以及了解纳米通道的作用机制具有重要意义。

收获时间的复利

据介绍，近年来该课题组始终围绕纳米通道外表面在检测方面的应用和机理开展研究。当他们确定电荷的作用之后，便开始定下调控浸润性的目标。

为了让浸润性发生更大的变化，他们开始引入超分子结构。但在这时调控性能开始变差，这样一来就无法排除尺寸效应和电荷效应的影响，也就无法确定浸润性在电流变化中扮演的角色。

经过讨论之后该团队打算去繁化简，让序列中只剩下多肽。多肽，由一个个的氨基酸串联而成。

而对于氨基酸的性质此前已有不少研究，人们发现对氨基酸数量进行增减之后，就能实现多肽探针性质的精细调控。

利用上述方法，该课题组获得了较为理想的初步效果。随后，他们用实验来验证浸润性在这种体系里的作用，并将其用于检测生物系统中蛋白酶，借此发现了 MMP-2 酶与周期的关系。

期间，他们曾多次尝试使用具备多肽功能的纳米孔道，来监测活细胞的 MMP-2 酶，但却一直未能取得理想结果。

娄筱叮表示：“当面对困境我们该如何破局？这时我想到一句话：积力所举，则无不胜；众智所为，则无不成。或许团队之力，可以让课题迸发出新的生机。”

于是，她紧急召开一次团队会议。会上，她鼓励大家坦诚交流，共同审视实验步骤。最终，他们成功制定出新的实验方案，并获得令人满意的实验数据。

而在刚开始进行蛋白质孔道的工作时，有三大难关摆在他们面前：蛋白质如何诱导纯化？磷脂双分子层如何构建？蛋白质孔道结构如何搭建？

尽管已经做好要过五关斩六将的准备，但在实操之中依然遇到了意料之外的难题。

在其中一次实验里，他们需要以“50-150μm”的小孔作为载体，用毛笔刷出容易被蛋白插入的磷脂双分子层，整个过程如“引针穿线”一般，需要精细的手法和十足的耐心。

娄筱叮说：“我曾想过是否将这个课题放一放，可学生们没有放弃。也正是学生们‘我再试试’的坚持，让我有勇气带着大家向前走，哪怕只是小步地走，相信只要不间断就能够收获时间积累的复利，在长周期之后爆发巨大的能量。”

最终，相关论文以《酶对纳米通道外表面润湿性的调控》（Enzyme Regulating the Wettability of the Outer Surface of Nanochannels）为题发在 ACS Nano，HuJingJing 是第一作者，娄筱叮和夏帆担任共同通讯作者。

▲图 | 相关论文（来源：ACS Nano）

娄筱叮继续说道：“我还要特别感谢夏帆教授对这项工作的指导。”据介绍，她与夏帆的合作始于 2013 年。

当时，他们将有机分子与纳米孔道相结合，设计并合成了一系列荧光探针，这些探针主要基于小分子、核酸和多肽。同时，他们还打造了与功能纳米孔道相结合的生物传感器。

在荧光探针和生物传感器的帮助之下，他们针对生命复杂体系、动物器官、人体尿液以及病人组织样本中的靶标分子实现了直接检测。

在本次工作之外，其又聚焦于“空间限域”孔道内表面和外表面的离子调控，阐明了限域空间之下的物质传输新机制，借此构筑一种新的界面，这种界面具备可被精准功能化、以及可被表征的特点。

未来，该团队将继续致力于纳米孔道的研究，将蛋白孔道异质化用于蛋白质测序中。具体来说：

其一，他们将继续针对固体纳米通道外表面打造定向修饰的探针，通过电信号和光信号，来对蛋白质的折叠/解折叠状态进行动态分析。

目前，其已证明：双信号的整合可以增强纳米通道的能力，从而能让纳米通道根据半胱氨酸基团的暴露程度，来区分蛋白质的折叠状态，进而可以促进基于蛋白质构象的疾病诊断的发展。

其二，他们仍将深耕于蛋白纳米孔道的异质化工作。通过蛋白质工程来对蛋白纳米孔道的外表面和内腔，进行单位点的精细化改造，以期提高现有纳米孔道传感界面的空间分辨能力，从而实现不同分析物的精准区分，最终在蛋白质单分子测序上取得突破。