Science丨潘多加团队揭示Merlin通过形成固态样凝聚体调控Hippo信号通路

潘多加教授团队2022发表的研究表明，Hippo通路的上游抑制因子SLMAP与上游激活因子AMOT和KIBRA通过液-液相分离（LLPS）形成功能拮抗的生物分子凝聚体。这些功能相互拮抗的液态凝聚体可以进一步聚合成一个共同的凝聚体，从而调控Hippo通路。而本项发表于Science的工作则是研究了另一个重要的Hippo信号通路的上游调节因子Merlin。Merlin是一个经典的肿瘤抑制因子，其突变会导致神经纤维瘤病II型疾病（NF2）以及其它类型的肿瘤的发生。

为了研究Merlin在体内的功能和调控机制，作者建立了表达Merlin-mNeonGreen（Mer-mNG）荧光蛋白的果蝇系。Merlin是一个已知的细胞膜定位蛋白，荧光成像和光漂白实验结果显示，Merlin在极化的果蝇上皮细胞顶端细胞皮层（apical cell cortex）存在两个不同的定位：一部分动态Merlin蛋白位于细胞-细胞连接（cell junction）处，另一部分Merlin在顶端细胞皮层中部（medial apical cortex）形成非动态的颗粒（图1）。果蝇细胞内形成的Merlin颗粒高度稳定，用细胞裂解液稀释或1,6-Hexanediol化合物处理都不能溶解Merlin颗粒，同时体外纯化的Merlin蛋白也能形成非动态的稳定颗粒。这些实验结果表明，Merlin能够形成具有固态物理特性的生物分子凝聚体。

图1. Merlin及其突变体形成具有不同物理特性的凝聚体（Credit: Science）

通过对Merlin蛋白结构域分析发现，Merlin凝聚体的形成由卷曲螺旋结构域（coiled-coil domain，CC）介导，CC结构域突变（mutCC）后Merlin不能形成凝聚体，并且无法定位到细胞膜上。为了研究Merlin凝聚体固态样物理性质的重要性，作者在Merlin mutCC突变体蛋白里分别引入DIX或FUS结构域从而构建两个新的融合蛋白。这两个能够多聚化的蛋白结构域的引入使Merlin mutCC突变体恢复了凝聚能力。荧光成像和光漂白实验显示DIX融合蛋白形成非动态、稳定的固态样凝聚体，并且只定位于顶端细胞皮层中部。

与之不同，FUS融合蛋白主要定位于细胞连接处，同时形成少量高度动态，位于顶端细胞皮层中部的液态样凝聚体。已知在果蝇卵室（egg chamber）后部的follicle 细胞里，Hippo通路的阻断（包括Merlin失活）会导致cut基因的异常高表达。利用这一表型，作者检验了融合蛋白的活性，发现野生型Merlin蛋白和DIX融合蛋白都能恢复merlin突变细胞cut基因的正常表达，但是mutCC突变体和FUS融合蛋白则不能恢复。这一结果表明Merlin只有在形成固态样凝聚体时才能在体内正常介导Hippo信号传导（图2）。

图2. Merlin凝聚体的固态物理特性对其活性至关重要（Credit: Science）

进一步研究发现， Merlin通过与细胞膜上的磷脂酰肌醇-4-磷酸（PI4P）直接结合定位到细胞膜上，而膜上PI4P的浓度可以调控Merlin的定位；反之Merlin的凝聚也可以影响其与PI4P的结合。通过正向遗传筛选，作者发现另一个Hippo通路上游调节因子Pez可以通过增加顶端细胞膜中部的PI4P浓度来促进Merlin的凝聚。这些结果揭示了一种Merlin固态样凝聚体的正向调控机制。

与Pez不同，细胞骨架张力（cytoskeletal tension）一方面可以通过减少顶端细胞膜中部的PI4P从而抑制Merlin凝聚体的形成，另一方面也能直接作用于Merlin凝聚体促进它的解聚。通过改变细胞外液体渗透压从而改变细胞骨架张力，作者发现低细胞张力促进Merlin固态样凝聚体的形成，而高细胞张力则促进Merlin凝聚体从固态到液态的物理状态转变，并导致Merlin凝聚体的解聚。有意思的是，被锁定在固态样的DIX融合蛋白凝聚体可以抵抗高细胞张力引起的解聚。另外，以前的研究发现在果蝇卵室里，缺氧可以引起细胞膜上PI4P浓度的显著下降。利用这一系统，作者发现Merlin凝聚体的固态样物理特性使得它可以抵抗缺氧导致的Merlin蛋白从细胞膜的脱落。

图3. 固态样Merlin凝聚体在极化上皮中的功能和调控（Credit: Science）

综上所述，本项研究首次揭示了肿瘤抑制因子Merlin在体内形成固态样凝聚体，并发现这些凝聚体的固态样材料特性不仅对于其生理功能至关重要，还能保护它们免受如缺氧和低渗透压等外部扰动的影响。该研究提示固态样生物分子凝聚体的固态样物理性质可能是一种维持信号稳定性的普遍机制，同时固态样凝聚体的形成和解聚可以受到双向调控以满足不同的生理功能需求（图3）。