JITC：科学家筛选到靶向PD-1/PD-L1的小分子抑制剂，可促进杀伤性T细胞进入肿瘤

基于免疫检查点抑制剂的免疫治疗，已经成为抑制多种肿瘤进展的有效手段之一[1,2]。

然而，目前仍有大量患者对已经获批用于临床的免疫检查点抑制剂（大多属于单克隆抗体药物）没有反应[3]。

此外，单克隆抗体需要静脉注射且生产成本高昂，这也在一定程度上限制了它们在临床上的应用。

众所周知，口服小分子抑制剂具有较高的生物利用度，较短的半衰期，以及在肿瘤病灶中有更大的扩散速率[4]。因此，近年来越来越多的科学家开始研发靶向PD-1/PD-L1的小分子抑制剂。

据了解，截至目前尚无针对PD-1/PD-L1的有效小分子抑制剂获得临床批准。

近日，由葡萄牙里斯本大学Helena F. Florindo和Rita C. Guedes，以及以色列特拉维夫大学Ronit Satchi-Fainaro领衔的研究团队，在著名期刊Journal for ImmunoTherapy of Cancer（JITC）发表了他们关于新型PD-L1小分子抑制剂筛选的重要研究成果[5]。

在本研究中，研究人员利用计算机辅助的药物筛选技术，发现了可以调节PD-1/PD-L1相互作用的新型小分子抑制剂。他们从体外细胞实验、小鼠T细胞离体再培养实验和小鼠体内抗肿瘤实验三个层面评估了该抑制剂调节PD-1/PD-L1相互作用和增强T细胞功能的能力。

结果表明，他们筛选到的PD-1/PD-L1信号通路小分子抑制剂，可以有效抑制PD-1/PD-L1信号通路，促进小鼠细胞毒性T细胞（CTL）向肿瘤微环境的广泛浸润且没有明显的系统毒性。

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话不多说，让我们一起来看看研究人员是如何展开这项研究的。

首先，为了发现新的PD-1/PD-L1小分子抑制剂，研究人员进行了一项基于人PD-L1晶体结构的虚拟筛选。他们通过分子对接从多个合成化合物库（National Cancer Institute，Enamine，Specs，Mu.Ta.Lig Chemoteca，MMV和研究团队自己的合成化合物库）里筛选了近90万种化合物。

基于人PD-L1晶体结构的虚拟筛选

随后，研究人员对对接排名靠前的化合物进行更为详尽的对接分析，以更高的精度预测相应化合物在受体结合口袋中的结合姿势和相互作用。最后，他们依据“五倍率法则”筛选出了最终的95种候选化合物。

紧接着，研究人员通过对比95个候选化合物与阳性对照BMS202（小分子抑制剂）的均相时间分辨荧光（HTRF）信号水平，确定了16个可以抑制PD-1/PD-L1信号通路的候选化合物。而根据剂量反应性和化合物稳定性再次筛选，剩余10个候选化合物。

参考BMS202的作用模式，研究人员假设候选化合物与PD- L1结合后可以使PD-L1更稳定。他们利用热变性实验对此进行验证，发现上述10个候选化合物均能使PD-L1的热稳定性提高3-4℃。随后，研究人员用梯度光谱法核磁共振实验（WaterLOGSY NMR）验证这些候选化合物与PD-L1的结合能力，获得了最有希望的小分子抑制剂SM69。

这些结果表明，候选化合物具有类似于BMS202的作用模式，可通过结合PD-L1干扰其与PD-1的相互作用。

仅依靠化学检测手段无法确认其生物学效果。为此，研究人员对前述10个候选化合物进行体外细胞实验验证。研究人员利用细胞代谢活性实验评估了上述化合物对人乳腺癌细胞MDA-MB-231和黑素瘤细胞A375细胞活力的影响；同时评估他们对内皮细胞HMEC的毒性，以模拟脱靶引起的系统毒性。经过上述实验，研究人员最终筛选出6个有潜力的PD-L1小分子抑制剂。

候选化合物调节PD-1/PD-L1相互作用

随后，研究人员以抗PD-L1抗体为对照，在MDA-MB-231和A375上评估了上述小分子抑制剂对PD-1/PD-L1相互作用的影响，发现大部分化合物对PD-L1有影响，但效果均弱于抗PD-L1抗体。与前述依靠化学检测手段筛选的结果一致，SM69对PD-L1的抑制效果最佳。

SM69诱导T细胞激活

为了测试SM69对PD-1/PD-L1抑制以及T细胞活化的影响，研究人员使用患者来源的外周血单个核细胞（PBMC）及其自体肿瘤细胞进行2D共培养实验。

通过检测共培养后T细胞的PD-1，IFN-γ及CD107a的表达水平，研究人员发现SM69与抗PD-L1抗体均能抑制T细胞PD-1表达，上调其IFN-γ及CD107a的表达。此外，虽然SM69与抗PD-L1抗体都能抑制抗原呈递细胞（APC）的PD-L1表达，但只有前者能够提高APC的比例。

随后，研究人员利用患者来源的黑素瘤细胞及其自体PBMC建立了3D肿瘤球，来验证SM69与抗PD-L1抗体处理对离体T细胞浸润肿瘤球的影响。结果表明，与未经处理组及抗PD-L1抗体处理组相比，SM69对PD-1/PD-L1的抑制导致肿瘤球内CD8+T细胞浸润更多。

体内抗肿瘤实验及TME分析

仅仅依靠小鼠T细胞离体再培养实验无法模拟体内复杂的情况，还无法准确验证SM69的效果。

为此，研究人员在人源化PD-1的小鼠体内建立了表达人源化PD-L1的结直肠癌模型（MC38-hPD-L1），并以10 mg/kg的剂量连续腹腔注射SM69共计10天。

结果表明SM69与阿替利珠单抗类似，均显著抑制肿瘤生长，且无明显的系统毒性。而通过与阿替利珠单抗治疗后小鼠TME中的T细胞对比，研究人员发现SM69的治疗诱导了更高水平的CD107a+CTL和更低水平的Treg细胞浸润。

总而言之，为了制备针对PD-1/PD-L1信号通路的有效小分子抑制剂，研究人员使用了计算机辅助筛选的方法。基于人PD-L1蛋白晶体结构，他们从合成化合物库中虚拟筛选了近90万种化合物，并最终识别出了95种候选化合物。随后，研究人员利用一系列化学检测手段筛选出最具潜力的小分子抑制剂。接下来，他们利用体外PD-1/PD-L1相互作用验证，证明了SM69可以成功抑制PD-1/PD-L1相互作用。最后，利用2D和3D黑色素瘤、乳腺癌细胞与离体T细胞共培养实验验证，体内抗肿瘤实验及TME分析，研究人员再次确认了SM69可以成功抑制PD-1/PD-L1相互作用，激活T细胞的功能，并在体内将CTL招募到TME，从而抑制肿瘤生长。

这项工作再次证明了设计小分子免疫检查点抑制剂的可能性。小分子抑制剂可以克服单克隆抗体有限的TME扩散，难以靶向其他细胞PD-L1的限制，这可能引起免疫治疗的革新。此外，小分子抑制剂的生产成本普遍较低，使得其具有更高的临床应用可能。

参考文献：

[1] Topalian SL, Drake CG, Pardoll DM. Immune checkpoint blockade: a common denominator approach to cancer therapy. Cancer Cell. 2015;27(4):450-461. doi:10.1016/j.ccell.2015.03.001

[2] Brahmer JR, Tykodi SS, Chow LQ, et al. Safety and activity of anti-PD-L1 antibody in patients with advanced cancer. N Engl J Med. 2012;366(26):2455-2465. doi:10.1056/NEJMoa1200694

[3] Pardoll DM. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 2012;12(4):252-264. Published 2012 Mar 22. doi:10.1038/nrc3239

[4] Zhan MM, Hu XQ, Liu XX, Ruan BF, Xu J, Liao C. From monoclonal antibodies to small molecules: the development of inhibitors targeting the PD-1/PD-L1 pathway. Drug Discov Today. 2016;21(6):1027-1036. doi:10.1016/j.drudis.2016.04.011

[5] Acúrcio RC, Pozzi S, Carreira B, et al. Therapeutic targeting of PD-1/PD-L1 blockade by novel small-molecule inhibitors recruits cytotoxic T cells into solid tumor microenvironment. J Immunother Cancer. 2022;10(7):e004695. doi:10.1136/jitc-2022-004695