生命蓝图新窗口！Nature Methods：二维类胚胎延时培养，首现人类中胚层“乾坤大挪移”全景

神奇的“二维类胚胎”：如何模拟人类早期发育？

首先，让我们简单了解一下2D类胚胎是如何模拟人类早期发育的。研究人员将人类多能干细胞种植在圆形微图案上，然后用BMP4（骨形态发生蛋白4）处理。BMP4是一种重要的信号分子，在胚胎发育中扮演着诱导原条形成的关键角色，尤其是在胚胎的胚外组织（extraembryonic tissues）中。在这种特定的微环境和信号刺激下，hPSCs会自发地形成一个具有特定空间组织的集落，就像人类早期胚胎的简化版。

在BMP4处理后的约48小时，传统的2D类胚胎模型会形成一个中心区域的多能干细胞（SOX2+），被一圈原条样细胞（TBXT+）环绕，再外面是原始生殖细胞样细胞（PGC-like cells）环，最外层是羊膜样细胞（amnion-like cells, ISL1+）。这个结构在xy平面上确实模拟了早期胚胎的模式，简单且可重复。

然而，仅仅模拟最初的48小时是远远不够的，因为原条形成后，大规模的细胞迁移和分化才会真正启动。

突破时间壁垒：将模拟时窗延长至10天！

这项研究的关键创新在于优化了培养方案，成功地将2D类胚胎的培养时间延长到了10天！他们使用了限定性基础培养基（mTeSR1），在多孔板中培养，并在BMP4处理前额外进行了24小时的微图案培养，并在分化过程中坚持每日更换培养基。

得益于这一新方案，研究人员发现，从48小时到96小时（也就是第2天到第4天），2D类胚胎经历了高度可重复的形态发生，而且这种变化主要发生在垂直方向（z方向）。以往在传统的MEF-CM培养基中，类胚胎在96小时后就会变得混乱无序，但新方案下的类胚胎在96小时依然保持着高度有序的结构。

荧光染色和图像分析显示，在96小时，集落的边缘相对中心升高，集落整体在径向方向略有扩张。在集落中心，形成了一个由多层细胞组成的结构。通过对关键标记物（如ISL1、SOX2、TBXT）的染色，他们发现，虽然在xy平面上这些经典标记物的分布大致维持了最初的模式（中心SOX2+，环状TBXT+，边缘ISL1+），但在z方向上，中心区域由多层SOX2阳性的细胞核组成，这些细胞同时高表达NANOG和POU5F1，表明它们是类似多能性的外胚层细胞，并且形成了一个类似假复层上皮（pseudostratified epiblast-like layer）的结构，其顶部表达顶端表面标记物PODXL。

更令人兴奋的是，这个假复层上皮层下方，出现了一个新的细胞层。对上皮（EPCAM, ECAD）和间充质（mesenchymal cells, SNAIL, NCAD, VIM）标记物的染色证实，这个下方的新层是间充质细胞。

中胚层的“家族成员”：原来分化得这么细致！

为了弄清楚下方这些间充质细胞到底是什么类型，研究人员进行了单细胞转录组测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）分析，收集了48、72和96小时的细胞数据。

通过将细胞聚类并分析其基因表达谱，他们发现了多种细胞类型，包括羊膜外胚层样细胞、原始生殖细胞样细胞、确定性内胚层（definitive endoderm），以及多个中胚层亚群。

这些中胚层亚群的划分并非一成不变，随着时间的推移（从48小时到96小时），它们在转录组层面呈现出动态的变化和连续性。研究人员识别出了与CS7人类胚胎（人类发育早期的一个特定阶段）中新生中胚层（Nascent Mesoderm）和高级中胚层（Advanced Mesoderm）相似的细胞群。

进一步细化聚类后，他们发现在第4天（96小时），高级中胚层样的细胞群可以进一步分为侧板中胚层样细胞（Lateral Plate Mesoderm-like Cells, LPM-LCs）和连接干样细胞（Connecting Stalk-like Cells, CS-LCs）。LPM-LCs的标记物包括TBX4、PITX1、MLLT3和ALCAM。CS-LCs的基因表达谱也具有独特性，并映射到胚外中胚层（extraembryonic mesoderm）所在的区域，这一点与2D类胚胎中存在羊膜样细胞是一致的。

新生中胚层样的细胞群则表现出向更特定命运过渡的迹象，例如一个亚群表达FOXC2，这与体节（somite）前体细胞的标志物一致，提示它们可能是前体体节中胚层样细胞（anterior paraxial mesoderm-like cells, aPM-LCs）。

为了验证这些细胞类型的身份并了解它们与体内（in vivo）发育的相似性，研究人员将这些scRNA-seq数据与CS7人类胚胎和CS8猴子胚胎的数据进行了比较映射。结果显示，2D类胚胎中的LPM-LCs、CS-LCs和aPM-LCs与人类/猴子胚胎中相应区域的细胞高度相似，例如，超过85%的2D类胚胎LPM-LCs细胞成功映射到了猴子胚胎的侧板中胚层细胞群，而且它们的基因表达谱（如TBX6、FOXC2、HAND1在新生中胚层中的重叠表达）也与猴子胚胎高度一致。

这些数据强有力地证明，这种延长的2D类胚胎培养模型能够可靠地生成多种具有体内相似性的中胚层亚群。

“定向大迁移”：中胚层细胞的精准导航

光有细胞类型还不够，它们是如何到达特定位置并形成有组织结构的呢？研究人员通过免疫荧光染色和活细胞成像及细胞追踪技术，捕捉到了中胚层细胞迁移的精彩瞬间。

免疫染色证实，在96小时，TBX6阳性细胞（主要代表体节前中胚层）和FOXF1阳性细胞（主要代表侧板中胚层和胚外中胚层）形成了清晰的空间组织。TBX6阳性细胞形成了一个位于集落中心、外胚层下方的层，以及一个位于集落边缘、在48小时原条所在位置下方的环。而FOXF1阳性细胞则主要位于集落的最边缘。

这个空间分布暗示了细胞可能从某个中心区域迁移出去。活细胞成像证实了这一点！从大约48小时开始，原条样区域（TBXT+细胞）的细胞开始向外迁移。通过对这些迁移细胞进行追踪，研究人员发现，最终停留在集落中心区域的TBXT阳性细胞，几乎全部都起源于原条所在的环状区域。

迁移是有方向性的吗？是的！对细胞运动方向的定量分析显示，向内迁移的细胞展现出明显的方向性——它们更有可能沿径向向内移动，而不是其他任何方向。

除了向内的迁移，研究人员还观察到细胞向集落边缘的向外迁移，这可能形成了集落边缘的FOXF1阳性细胞群。与单个细胞的向内迁移不同，向外迁移可能表现出集体性（成群细胞一起移动），随后沿集落边缘进行切向移动。

细胞从原条区域迁出通常伴随着基底膜（basement membrane）的降解。研究人员发现，在2D类胚胎的原条样环状区域，基底膜蛋白层粘连蛋白（laminin）的水平最低，这与体内原条区域细胞迁移时细胞外基质（extracellular matrix, ECM）发生变化的现象一致。

所有这些证据表明，就像在活体胚胎中一样，2D类胚胎中的不同中胚层亚群从原条样区域出发，进行有方向性的迁移，并最终形成了有空间组织的细胞分布。

信号“指挥家”：调控中胚层命运的分子密码

细胞的命运和行为常常受到信号通路（signaling pathways）的精密调控。研究人员探索了BMP、Wnt和Nodal这三种在早期胚胎发育中至关重要的信号通路，如何影响这些中胚层亚群的形成和分布。

BMP信号是侧板中胚层形成的关键。研究人员发现在96小时，BMP信号的激活标记物pSmad1/5/9在集落边缘最高，并向中心延伸。FOXF1阳性的侧板中胚层样细胞主要位于集落边缘，这与BMP信号强度较高区域重叠。如果在48小时后移除培养基中的外源性BMP4，对FOXF1表达影响微乎其微，说明此时的BMP信号主要来源于内源性分泌。而如果使用BMP受体抑制剂，则几乎完全消除了FOXF1的表达，强有力地证明侧板中胚层样细胞的形成依赖于BMP信号。有趣的是，TBX6的表达并未因BMP抑制而降低，反而略微向外扩张。

Wnt信号对体节前/体节样中胚层（主要表达TBX6）至关重要。研究发现在48小时后抑制Wnt信号，消除了TBX6阳性的原条样环状结构，并显著减少了中心区域的TBX6阳性细胞数量，但对FOXF1或ISL1表达影响不大。这表明Wnt信号对于维持TBX6阳性中胚层至关重要。

Nodal信号在胚胎发育中也扮演着重要角色，高Nodal信号通常会促进内胚层形成。研究人员通过添加Activin（一种增强Nodal信号的分子）或使用Lefty1/2双敲除（double-knockout, DKO）细胞（Lefty1/2是Nodal信号的抑制剂，敲除它们会增强Nodal信号），发现高Nodal信号会抑制中胚层的形成。Activin处理强烈减少了FOXF1阳性细胞和TBX6阳性细胞。Lefty1/2 DKO细胞也表现出类似的趋势，强烈减少了FOXF1，TBX6虽然仅部分减少，但其高表达区域转移到了集落边缘。这些结果一致表明，高Nodal信号与中胚层形成存在拮抗作用。

总而言之，信号通路的调控作用与细胞类型和空间分布之间存在密切联系：BMP信号驱动集落边缘的侧板中胚层样细胞形成，而Wnt信号则对集落中心和环状结构的体节前/体节样中胚层至关重要。

延伸时窗的收获：发现侧板中胚层衍生物

将2D类胚胎培养时间延长至10天，还能看到什么？研究人员持续观察和分析了更长时间（第6、8、10天）的发育情况。

他们发现，虽然体节前中胚层样细胞（aPM-LCs）在第6天后显著减少，到第10天几乎消失了，但侧板中胚层（LPM）的衍生物却持续发育。

通过染色发现，代表体节的FOXC2在第6天后从中心消失，更多地分布在外周。另一个体节标记物MEOX1在第8天开始出现，并与外周的FOXC2高表达区域重叠。代表心脏的NKX2-5在第6-10天向内延伸，并随着MEF2C的增加而减少。ACTN2（成熟心肌标记）在第8天表达较低。

进一步的scRNA-seq分析（涵盖第6、8、10天数据）证实，除了外胚层，还出现了内皮细胞（endothelial cells, EC）和心脏间充质样细胞（cardiac mesenchyme-like cells, CMes-LCs）等新的细胞类型。

内皮细胞（CDH5+PECAM1+）表达FOXC2、GATA4，但NKX2-5水平较低，这与心内膜（endocardial）的身份标记一致。这些内皮细胞在模型中常常排列成管腔结构，尽管固定时可能塌陷。

心脏间充质样细胞（CMes-LCs）则表达NKX2-5、HAND2、ACTA2、MYOCD，同时表达SOX9、ERBB3、MEOX1、FOXC2等标记物。这些标记物组合表明它们已经超越了早期的心脏中胚层阶段，更像是心脏垫（cardiac cushions）的间充质。心脏垫是心脏瓣膜和间隔发育的关键结构，其间充质主要通过内皮-间充质转分化（endothelial-to-mesenchymal transition, EMT）形成，这个过程受到BMP和TGFβ信号的驱动，而这些信号在培养基中是存在的。这意味着2D类胚胎虽然在长时间培养中失去了体节前中胚层，但意外地展现出了模拟心脏垫间充质形成的潜力！

模型的意义与未来：窥探生命奥秘的有力工具

这项研究首次展示了将2D类胚胎培养时间延长至10天的可能性，并揭示了在第2天到第4天之间，中胚层经历的高度可重复且有组织的形态发生和模式形成，这与人类早期胚胎发育的某些后期阶段相似。

这项工作的重要意义在于：

重新思考中胚层分化： 研究结果表明，“新生中胚层”、“高级中胚层”等术语可能需要重新考虑。scRNA-seq数据显示，从原条区域迁出的不同中胚层亚群，可能沿着转录组连续谱（transcriptional continuum）代表着不同谱系的前体细胞，而非同一谱系的不同发育阶段。

解析中胚层迁移机制： 2D类胚胎的简单性和可控性使其成为研究中胚层迁移机制的绝佳模型。细胞在2D平面上的运动非常适合进行高分辨率的活细胞成像和细胞追踪。未来可以利用这个平台探索哪些化学趋化因子（chemo-attractants）或排斥因子（repellents）在起作用，或者细胞迁移的机械力（mechanical forces）如何发挥作用。

研究信号调控与模式形成： 该模型可以精确地操作信号通路（如该研究所示），并定量分析其对细胞命运和空间模式的影响，有助于更深入地理解胚胎模式形成的分子逻辑。

发现侧板中胚层衍生物： 延长培养时间看到了内皮细胞和心脏间充质样细胞的出现，为研究这些特定谱系（特别是心脏垫发育）提供了新的体外模型。

符合伦理规范： 与包含胚外组织的整合型胚胎模型相比，2D类胚胎不含滋养外胚层（trophectoderm）和下胚层（hypoblast），发育潜力有限，更符合相关的伦理指导原则。

当然，2D类胚胎模型也有其局限性。它缺乏活体胚胎中的对称性破缺（symmetry breaking），无法形成清晰的前后轴和内侧-外侧轴。这可能是由于缺乏下胚层所致，也意味着迁移细胞所处的微环境与体内不同，这可能解释了为什么某些细胞类型（如体节前中胚层）在后期消失。简单来说，在2D模型中理解细胞的“向内”和“向外”移动与体内“内侧”和“外侧”移动的对应关系还需要进一步探索。

尽管存在局限性，这项研究通过延长培养时间、结合多学科技术（先进成像、单细胞测序、遗传操作、信号调控），证明2D类胚胎模型是一个强大且易于操作的工具，能够帮助我们回答关于人类中胚层发育的一些此前难以触及的关键问题。

这项研究不仅深化了我们对人类胚胎发育早期复杂过程的理解，也为开发更可靠的干细胞定向分化技术奠定了基础，最终有望为治疗与中胚层发育相关的出生缺陷提供新的视角。