Nature：重新设计Cas9蛋白，解决脱靶问题，让基因编辑更安全
来源：生物世界 2022-03-05 21:58
CRISPR-Cas9基因编辑技术，通过向导RNA（gRNA）将Cas9酶靶向目标DNA序列，Cas9酶切割目标DNA双链，造成DNA双链断裂，DNA在非同源末端连接（NHEJ）修复时出错，从而实现基因敲除。然而，CRISPR-Cas9存在较为严重的脱靶效应，可能会在错位的基因位点切割DNA双链，从而导致潜在风险，这也是限制CRISPR-Cas9基因编辑临床
CRISPR-Cas9基因编辑技术，通过向导RNA（gRNA）将Cas9酶靶向目标DNA序列，Cas9酶切割目标DNA双链，造成DNA双链断裂，DNA在非同源末端连接（NHEJ）修复时出错，从而实现基因敲除。
然而，CRISPR-Cas9存在较为严重的脱靶效应，可能会在错位的基因位点切割DNA双链，从而导致潜在风险，这也是限制CRISPR-Cas9基因编辑临床应用的一大因素。目前，国内外已开始进行多项基于CRISPR-Cas9基因编辑的临床试验，降低其脱靶效应是一个亟待解决的问题。
美国德州大学奥斯汀分校的研究团队在 Nature 期刊发表了题为：Structural basis for mismatch surveillance by CRISPR–Cas9 的研究论文。
研究团队首先发现了CRISPR-Cas9基因编辑系统中脱靶背后的结构机制，在此基础上重新设计了Cas9蛋白——SuperFi-Cas9，其脱靶概率降低了数千倍，且编辑效率与原始版本的Cas9蛋白相同。
CRISPR-Cas9基因编辑，通过向导RNA（gRNA）将Cas9酶靶向目标DNA序列，Cas9酶切割目标DNA双链，造成DNA双链断裂，从而实现基因编辑，其中，向导RNA（gRNA）长度为20bp，通过与目标DNA的碱基互补配对来识别需要编辑的位点，然而，有时候在第18-20个碱基不匹配时，Cas9酶仍能进行编辑，从而导致脱靶效应。
研究团队使冷冻电镜来观察Cas9与错配的DNA序列相互作用时候的结构变化，从而解析错配时Cas9的激活机制。
研究团队惊讶地发现，当向导RNA（gRNA）在第18-20个碱基错配时，这时的配对结构较为松散，但Cas9酶并没有放弃前进，而是通过一个手指状结构紧紧抓住了错配区，从而稳定了RNA-DNA双链，使其表现的像是正确配对，为Cas9对DNA的切割铺平道路。论文的第一作者 Jack Bravo 表示，这种情况就像一把椅子，其中一条腿断了，用胶带粘上，这时候它仍然可以作为椅子使用，但是有些摇摆不定。
俗话说，眼见为实，该论文的通讯作者 David Taylor 表示：如果不是通过冷冻电镜看到了Cas9在向导RNA（gRNA）错配时出现的这种手指状结构，自己在脑海里永远也想不到Cas9是通过这种机制增加了错配时的结构稳定性，从而出现脱靶效应。
基于这一开创性发现和见解，研究团队重新设计了Cas9酶，这一新版本的Cas9酶——SuperFi-Cas9，它的手指状结构部分被改造成远离DNA，从而在错配时，不会用来稳定错配结构，因此Cas9酶就不再在错配位点切割和编辑DNA序列。
更重要的是，重新设计的SuperFi-Cas9，可以像天然Cas9酶一样高效编辑DNA，但脱靶概率下降了约4000倍，因此安全性得到了大幅提升。
目前，已经有其他实验室通过重新设计Cas9来降低其脱靶效应，但所有这些Cas9版本都通过牺牲基因编辑效率来提高准确性。
对于这种现状，这篇 Nature 论文的第一作者 Jack Bravo 做了一个形象的比喻：不同实验室开发的不同Cas9版本就像不同型号的自动驾驶汽车，大多数都很安全，但它们的最高速度只有10英里/小时，虽然安全性提高了，但实用性也消失了。而SuperFi-Cas9则是一辆可以全速行驶且非常安全的自动驾驶汽车，SuperFi-Cas9的脱靶概率比原始版本Cas9要降低4000倍，而且编辑效率一样高。
目前，研究团队已经证明了SuperFi-Cas9在试管中对DNA的编辑，在活细胞中测试的实验正在进行中，他们还在同步开发更安全、更高效的Cas9新版本。（生物谷Bioon.com）
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