心脏AAV基因治疗临床转化的思考

心力衰竭和缺血性冠状动脉疾病仍然是全世界发病率和死亡率最普遍的原因。尽管传统心脏护理的进步大大降低了冠心病和急性心肌梗死的死亡率，然而，心力衰竭的患病率在老龄化人口中持续增加，这具有深远的社会和经济后果。使用腺相关病毒(AAV)载体的心脏基因治疗正在成为解决这一迫切临床需求的潜在模式。

在广泛的临床前研究和早期临床试验中显示出最初的希望后，令人失望的大规模临床试验结果破坏了AAV介导的心脏基因治疗的进展。然而，近年来，从以前的失败中获得的经验加上靶向基因递送的发展似乎已经为心脏AAV基因治疗的新前沿奠定了基础，这一现状或将得到打破。本文将就目前使用AAV进行心脏治疗临床现状和面临的挑战和有效性制约进行综述。

最早关于心脏靶向的AAV临床实验起始于20世纪末。那时主要针对心脏血管生成的基因治疗主要采用了质粒DNA和腺病毒这两种递送方式。促进血管生长的基因如血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和肝细胞生长因子(HGF)的靶向递送在临床前和早期临床试验中显示出有希望的疗效，但较大的后期试验大多未能显示出一致的益处。这些试验都没有导致常规临床治疗的改变。而随着AAVs的出现，关于心脏的基因治疗主要转向了这种载体。

使用AAV治疗心脏的临床开始于Roger J. Hajjar博士领导的使用AAV1递送SERCA2a。

Roger J. Hajjar博士

SERCA2a基因过表达可增强肌浆网钙泵逆浓度梯度重摄取心肌细胞内钙离子，从而改善心肌高钙环境。在广泛小动物，大动物，体外的临床实验中，AAV1-SERCA2a均证明了AAV1改善了心肌收缩性。然而，2007年在患者中开展的I/II a期试验CUPID却并不如人意。尽管早期试验证明有临床事件减少，但2015年随后发布的临床数据表明，AAV1/SERCA2a在测试剂量下并未改善心力衰竭和射血分数降低患者的临床进程。临床也随之终止。

此次失败对于AAV心脏治疗打击无疑是巨大的，在那之后直到2019年关于AAVs治疗心脏的临床试验才正式重启。

由Asklepios公司（于2020年被拜耳收购）赞助的临床试验NAN-101于2019年11月开始，目前正在检测基于嵌合AAV (BNP116)的蛋白磷酸酶抑制剂1基因递送对于充血性心力衰竭患者的效果。（NCT04179643）

此外，与心脏的相关的肌肉病（罕见病）的研究也在进行中。

例如Danon Disease和杜氏肌肉营养不良症（DMD）就是其中典型，其中Danon 是一种X连锁显性遗传病，患者由于溶酶体相关膜蛋白2（LAMP2）基因突变，导致骨骼肌和心肌减弱，以致多器官障碍，最终因严重心力衰竭死亡。Rocket Pharmaceuticals在2019年4月开展了一项利用AAV9-LAMP2B基因递送治疗男性Danon病患者的临床试验（NCT03882437），并通过静脉注射，进行全身注射。

此外，还有两项关于杜氏肌肉营养不良症（DMD）的临床，IGNITE DMD（NCT03368742)和PF-06939926（NCT03362502）也采用了AAV9，另有一项关于DMD的临床采用了AAVrh74的临床临床试验SRP-9001-102。

IGNITE DMD（NCT03368742)是由Solid Biosciences开展的一项研究，使用AAV9将合成dystrophin的基因（microdystrophin）递送给DMD患者身体。

PF-06939926（NCT03362502）是由辉瑞公司开展的一项研究，为15名患者提供迷你肌营养不良蛋白。辉瑞试验报告了肌肉基因转导和功能改善的积极结果，但在心脏功能方面，临床却遇到了挫折。三例患者在接受fordadistrogene movaparvovec治疗后出现了严重的肌无力不良事件，其中两起涉及心肌炎，并归因于研究药物。辉瑞的外部数据监察委员会审查了研究中的安全性发现，并且得出结论认为，在接受治疗后抗肌萎缩蛋白的某些突变可能与这些不良事件相关。

由此，辉瑞决定新的临床研究方案将排除具有外显子9至13突变（外显子缺失，复制，插入或点突变）或外显子29和30缺失的DMD患者。

IGNITE DMD临床也遭遇了相似的问题，由于接受治疗的患者出现与治疗相关的严重不良事件，使得2020年该试验暂停了一年，直到21年改变了临床方案才得以继续。

Sarepta Therapeutics公司的SRP-9001-102在安全性方面相比前两者似乎更有保证，但在有效性方面来看，目前似乎只有轻微疗效。

AAV心脏靶向的失败分析及尽管许多目前的临床试验失败原因仍然需要调查，但已公布的信息或许能提供一个合理的概览。

在前文提到的AAV1-SERCA2a临床试验中，研究人员检查了不幸死亡或接受心脏移植的受试者的心脏。出乎意料的是，在分析的组织中几乎没有发现病毒载体基因组，这表明基因转导有缺陷，而不是转基因功能无效，这一结果表明，递送问题仍然是AAV的首要需要解决的问题。

此外，在其他关于AAV的共性问题方面，AAV血清型、启动子和人类心脏递送方法的最佳组合仍待摸索，患者本身具有AAV具有中和抗体，AAV本身的高成本，临床过程中服用抗免疫药物的影响，难以评估体内AAV的转基因表达量，治疗前难以检测目标基因表达的降低等问题都是AAV心脏治疗的制约难题。

心脏AAV基因治疗的临床疗效受多种因素影响，但可分为3大类:调节基因转导的因素、与AAV转导基因相关的因素和与基因治疗接受者相关的因素。

调节基因转导的因素

基因转导效率是决定基因治疗成功与否的关键参数。重要的是，在临床试验中对基因转导效率进行一致的评估极具挑战性，因为心脏组织不容易获得，并且目前没有建立非侵入性追踪转基因表达的方法。与功能基因评估相比，上市前生产测试研究的心脏转导功效表征通常不太广泛，通常仅限于剂量测定研究。

调节心脏基因转导的关键因素包括载体、剂量和递送方法。这些因素是相互关联的，它们的最佳组合也可能取决于目标疾病、转基因和研究的动物物种。

例如，AAV血清型的嗜性可能因输送途径而异。血管内给药后，内皮屏障可能更多地抑制某些血清型的转导。尽管在啮齿动物研究中显示AAV9是最强的心脏调节因子，使用直接注射AAVs的大型动物研究通常显示使用AAV6是最强的心脏血清型调节因子。这是否是由于分娩方式或动物种类的差异仍不清楚。值得注意的是，尽管直接心肌内注射克服了内皮屏障，但基因表达的分布通常仅在注射部位周围。

给定载体的有效剂量也可能受给药方法的影响。启动子的选择是调节基因转导的另一个重要因素。AAV剂量和基因表达的关系会受到启动子效率的影响。然而，这种相互作用在人类心脏中的运作方式仍然未知，即使是常用的启动子。使用MRI或心内膜心肌活检进行转导分析的新临床研究可能会提高研究人员对这些因素的理解。

最后，基因递送方法也可以影响基因转导和分布。目前的AAV基因治疗技术不允许100%的心脏转导，并且在基因递送后可以看到不同程度的异质性，其分布很大程度上受递送方法的影响。对于治疗效果，心脏中必须被转导的细胞的百分比可能取决于治疗基因。

与AAV转导基因相关的因素

这些因素与转导基因的功能和宿主对转基因的免疫反应有关。显然，递送到心脏的基因需要对人类疾病有治疗作用。

通常来说，转基因的功能在进入临床试验之前已经被很好地表征，并且基因转移的有效性和安全性得到临床前研究的支持。然而，动物模型在提供关于载体免疫反应性的可翻译信息方面能力有限。此外，人和动物之间细胞内信号和蛋白质功能/相互作用的差异可能会导致临床前研究中未发现的意外影响。

值得注意的是，改变心脏细胞的细胞特性也可能影响心脏的电生理特性，并导致心律失常增加。对转导基因的免疫反应也可能导致心律不齐。然而，在动物模型中检测心律失常可能很困难，因为心律失常监测器并不总是植入体内。又因为临床前研究往往持续时间相对较短，可能无法识别长期影响。

此外，非靶器官中的基因表达也可以诱导意外的效应。如上所述，在临床研究中缺乏成功的心脏基因转导的证据，排除了对转基因功能在人类中是否无效的评估。

与基因治疗接受者相关的因素

基因治疗的基本概念是通过在疾病环境中补充内源性低表达基因或抑制高活性基因来干预细胞内信号传导过程。这对于遗传性疾病来说很简单，因为人们知道内源性基因缺失或有缺陷。与之相反的是，当靶向更普遍的疾病如心力衰竭时，基因治疗的基本原理依赖于基于先前研究的靶基因的内源性表达低(或高)的假设。

然而，确认在心脏中基因表达水平是具有挑战性的，并且特定患者的实际蛋白水平可能没有失调。在这种类型的患者中，将某种基因的表达从正常增加到高水平可能没有太大益处。

这可能是CUPID试验中SERCA2a基因治疗的情况，因为较温和的患者群体被纳入后期研究(NYHA II级)，与早期试验中较严重的患者群体(NYHA III-IV级)形成对比。

而有限的证据表明，NYHA II类患者内源性SERCA2a表达较低，这凸显了该临床研究有待精心设计的重要性。这一差异可能使得试验结果不具有普遍性。

对于基因补充疗法，应该考虑相对于通过基因转导获得的基因表达水平的内源表达的丰度。根据现有内源基因和蛋白质表达的丰度，相同程度的过量表达可能导致10倍或少量增加。

与受体(患者心脏)相关的其他因素包括AAV递送期间和之后的免疫反应以及心脏病的类型。无论是急性还是慢性的免疫反应，免疫反应都通常会使基因转导的效力最小化。在没有剩余AAV能够在心肌存活的情况下，伴有大面积梗死的心力衰竭患者可能不会受益于旨在改善心肌细胞功能的基因治疗。

参考来源：

1.Yamada KP, Tharakan S, Ishikawa K. Consideration of clinical translation of cardiac AAV gene therapy. Cell Gene Ther Insights. 2020 Jun;6(5):609-615. doi: 10.18609/cgti.2020.073. Epub 2020 May 14. PMID: 32774893; PMCID: PMC7406214.

2.Hulot JS, Ishikawa K, Hajjar RJ. Gene therapy for the treatment of heart failure: promise postponed. Eur Heart J. 2016 Jun 1;37(21):1651-8. doi: 10.1093/eurheartj/ehw019. Epub 2016 Feb 27. PMID: 26922809; PMCID: PMC4887702.