PNAS：广州医科大学王斗等团队：扩增与切割握手言和，一锅CRISPR不再内耗

基于CRISPR的诊断（CRISPR-Dx）与等温核酸扩增相结合，已成为即时分子检测的一种有前景的策略。然而，其实际部署仍受限于工作流程相关的局限性。传统的两步形式操作繁琐，且在扩增产物转移过程中极易受到气溶胶污染，而简化的一锅形式往往因扩增和CRISPR介导的切割在同一反应容器中发生动力学竞争而导致灵敏度降低。

2026年9月9日，广州医科大学王斗，邓小燕，深圳技术大学葛晨晨和南方科技大学曲久鑫共同通讯在PNAS 在线发表题为“Harmonizing amplification and cleavage kinetics through crRNA scaffold mutation enables robust one-pot CRISPR–Cas12 diagnostics”的研究论文。该研究提出了一种广泛适用的一锅检测策略，称为突变支架介导的RPA-CRISPR/Cas12a（MS-CRISPR）。该方法将合理设计的点突变引入crRNA支架，以适度减弱Cas12a活化和切割动力学。这种动力学调谐防止酶过早耗尽新生的RPA扩增子——这是野生型系统中信号丢失的常见来源。

通过将切割延迟至足够扩增产物积累之后，MS-CRISPR显著增强了终点信号输出。使用这种动力学平衡系统，作者在15分钟内对SARS-CoV-2和甲型流感病毒均实现了1拷贝/μL的检测限，同时保持了完全闭管的工作流程，最大限度地减少气溶胶污染并简化操作。作者将该检测与无需仪器的侧向层析读数以及超便携、多重、低成本微流控平台（便携式无线等温核酸检测）相结合。使用患者样本的临床验证显示，对两种病毒靶标均达到100%的灵敏度和特异性。总之，MS-CRISPR建立了一个灵敏、多功能且可现场部署的快速病原体筛查平台。

核酸检测是准确病原体鉴定、临床管理和公共卫生监测的关键工具，在疫情控制中发挥着不可或缺的作用。实时qPCR因其卓越的灵敏度和特异性而被广泛接受为分子诊断的金标准。然而，其广泛实施受限于对精密热循环仪、标准化实验室基础设施和训练有素人员的依赖，这限制了其在初级保健和即时检测（POCT）中的使用。这些局限性加剧了对结合速度、灵敏度、便携性和操作简便性的分子诊断技术的需求。

在此背景下，等温扩增已成为常规PCR的有吸引力的替代方案。传统等温扩增技术如重组酶聚合酶扩增（RPA）和环介导等温扩增（LAMP）消除了热循环并实现了快速检测。然而，当单独使用时，这些方法，特别是RPA，易于形成引物二聚体和非特异性扩增，损害分析精度。同时，CRISPR/Cas系统，包括Cas12和Cas13，已迅速崛起为一类新的生物传感工具，因为靶标识别触发反式切割活性，提供了信号放大的内在机制。即便如此，独立的CRISPR检测通常仅达到皮摩尔范围的灵敏度，因此对于检测低丰度临床靶标仍然不足。因此，将RPA与CRISPR/Cas整合已成为通向更高分析灵敏度的主导途径，因为它在单一工作流程中结合了靶标扩增、双重识别特异性和良好的温度兼容性。

图1.传统单罐RPA- CRISPR/Cas12a检测与MS- CRISPR策略的机制比较（摘自PNAS ）

尽管有这些优势，RPA-CRISPR平台的实际部署仍受到若干关键障碍的阻碍。在两步形式中，扩增产物必须在开放管之间转移，产生繁琐的工作流程，极易受到气溶胶污染，从而导致假阳性结果。一锅设计在概念上更适合POCT，然而其性能常因扩增与CRISPR介导的切割之间的基本动力学不匹配而受损。在此类系统中，过量的核酸酶活性可在指数扩增完全建立之前消耗痕量扩增子甚至引物，导致信号抑制和灵敏度降低。已提出各种解决方案，包括使用粘性试剂的物理隔离、Cas酶的蛋白质工程以及crRNA活性的光响应调控。尽管每种策略都提供了渐进式改进，但它也引入了额外的系统复杂性、需要辅助仪器，或通过掺入外源组分而损害反应稳健性。因此，该领域仍然缺乏一个广泛适用的、简单的、稳定的且主要基于内源性反应设计的一锅CRISPR平台。

Cas12a激活与正确的crRNA组装及随后的构象重排紧密相关。保守的crRNA支架作为从非活性状态向催化胜任状态转变的关键决定因素。在此基础上，作者假设crRNA支架的合理工程化可以精细调控Cas12a催化动力学，而不依赖于物理分离或外部化学调节剂，从而在单一反应管中恢复扩增与切割之间的兼容性。在这一概念的指导下，作者开发了一个基于突变支架调控的通用一锅检测平台，称为MS-CRISPR。该平台能够在15分钟内高度灵敏地检测SARS-CoV-2和甲型流感病毒（IAV）两者，检测限低至1拷贝/μL，同时通过闭管工作流程显著减少气溶胶污染。为进一步增强现场适用性，作者还建立了两个互补的读数模块：用于视觉检测的无仪器侧向层析检测（LFA）和用于同时分析SARS-CoV-2和IAV的P-WIN。总之，这些进展建立了一个灵敏、多功能且临床适用的分子诊断平台，用于呼吸道病原体的快速即时筛查。

参考消息：https://doi.org/10.1073/pnas.2613134123